靖吉強(qiáng) 武世珍 郭洪梅 李舫

致藍(lán)狐肺炎的犬鏈球菌WF1株分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

靖吉強(qiáng) 武世珍 郭洪梅*李舫

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

為了有效控制藍(lán)狐肺炎的發(fā)生，減少藍(lán)狐肺炎的危害，試驗(yàn)采取現(xiàn)場(chǎng)觀察、細(xì)菌的分離培養(yǎng)和16S rRNA基因序列測(cè)定與比對(duì)等方法，對(duì)濰坊一藍(lán)狐養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生的藍(lán)狐肺炎進(jìn)行了病原學(xué)檢查。結(jié)果表明：從藍(lán)狐肺部分離到一株犬鏈球菌，命名為犬鏈球菌WF1株。說明藍(lán)狐在通風(fēng)不良、嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激，晝夜溫差較大等不利因素的刺激下，抵抗力下降，感染了犬鏈球菌，導(dǎo)致嚴(yán)重肺炎。通過對(duì)犬鏈球菌WF1株藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌耐藥性較強(qiáng)，但對(duì)美羅培南較為敏感。這對(duì)于藍(lán)狐肺炎的防控具有一定的指導(dǎo)意義。

藍(lán)狐 肺炎 犬鏈球菌 分離鑒定 藥敏試驗(yàn)

藍(lán)狐肺炎是藍(lán)狐養(yǎng)殖過程中常見的疾病，主要發(fā)生于每年的8~9月份，發(fā)病率有時(shí)高達(dá)50%~ 90%，致死率有時(shí)近10%。疫情暴發(fā)后，相鄰的藍(lán)狐場(chǎng)往往先后發(fā)病，具有很強(qiáng)的傳染性和破壞性，給廣大藍(lán)狐養(yǎng)殖企業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。2018年9月，濰坊一藍(lán)狐養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生肺炎后來山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院就診，現(xiàn)把病原分離鑒定情況匯報(bào)如下：

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病藍(lán)狐，取自濰坊某養(yǎng)殖場(chǎng)。血液瓊脂培養(yǎng)基購自濰坊天衡醫(yī)療器械有限公司。Baird-parker培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基均購自北京路橋技術(shù)股份有限公司。藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藍(lán)狐飼養(yǎng)場(chǎng)管理情況調(diào)查 山東濰坊某規(guī)?；{(lán)狐場(chǎng)，飼養(yǎng)藍(lán)狐4000只。藍(lán)狐籠具在進(jìn)狐前經(jīng)碘制劑噴霧消毒。地面撒生石灰，并與表層土混勻，砸實(shí)?；\舍位于遮陽棚下。遮陽棚南北走向，棚檐高2m，棚頂高2.5m，通風(fēng)良好，夏季防止藍(lán)狐被烈日暴曬。藍(lán)狐幼狐出生后，發(fā)育正常。飼喂雜魚、鴨架、雞架、雞蛋、豆粕、玉米面、麩皮以及多種微量元素和維生素組成的預(yù)混劑等構(gòu)成的混合日糧，所有飼料煮熟、攪碎后成糊狀飼喂。幼狐斷奶后20d免疫犬瘟熱活疫苗(CDV-11株)，按瓶簽注明頭份，用注射用生理鹽水稀釋，每只肌肉注射1ml(含1頭份)；間隔2周加強(qiáng)免疫一次。斷奶后50d免疫狐貍腦炎活疫苗(CAV-2C株)。當(dāng)非種用幼齡狐貍體重達(dá)到4~5kg左右時(shí)埋植褪黑激素。

1.2.2 藍(lán)狐飼養(yǎng)場(chǎng)發(fā)病情況調(diào)查 在正常飼養(yǎng)過程中藍(lán)狐陸續(xù)發(fā)病，病狐體溫升高，食欲下降，精神沉郁，呼喚不應(yīng)，呼吸增數(shù)，流鼻涕。不愿運(yùn)動(dòng)，有的關(guān)節(jié)腫大，癱瘓，長(zhǎng)時(shí)間臥伏。病狐發(fā)育遲緩，逐漸消瘦。病重者衰竭死亡，病程7~ 15d。發(fā)病期間投喂青霉素、林可霉素，效果不顯著。發(fā)病后1個(gè)月，隨著天氣逐漸涼爽，疫情停止。發(fā)病期間，共死亡當(dāng)年幼狐359只，死亡率為8.9 %。未埋植褪黑激素的成年種狐和幼齡種狐發(fā)病較少。

1.2.3 病理變化檢查 剖檢瀕臨死亡的藍(lán)貍5只，可見肺部腫脹，出血，胸腔積液。心、肝和腎未見明顯異常。腸內(nèi)容物很少，腸管未見明顯出血性變化。

1.2.4 犬瘟熱檢查 按照林特睿檢TM犬瘟熱抗原快速診斷試紙的說明書進(jìn)行操作，取5只病狐眼、鼻、口的分泌物，溶于試劑盒的緩沖液中，然后取4滴緩沖液加入試紙卡的加樣孔中，5~10 min內(nèi)讀取結(jié)果。

1.2.5 觸片、染色、鏡檢 常規(guī)無菌操作采集5只病狐肺臟，用滅菌鑷子夾住肺臟一角，用無菌手術(shù)刀切下一塊肺臟，用潔凈的玻片在肺臟的新鮮切面上接觸一下，玻片上留下一硬幣大小的印跡。觸片干燥后，將玻片通過酒精燈火焰的外焰3~4次，進(jìn)行固定。然后用革蘭氏染色液染色、顯微鏡油鏡檢查。

1.2.6 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 常規(guī)無菌操作采集5只病狐肺臟，放入滅菌的平皿。手持烙刀，先在酒精燈火焰的外焰燒熱至微紅，然后放在病肺表面片刻，大約0.2min。然后在病肺被烙過的地方用烙刀捅一個(gè)小口。取滅菌的接種環(huán)插入烙刀捅出的小口內(nèi)，蘸取小口內(nèi)的病料后分別接種Baird-parker培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

1.2.7 16S rRNA基因序列測(cè)定與比對(duì) （1）分離菌基因組DNA提取：取血液瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的具有完全溶血性的小菌落，接種另一血液瓊脂培養(yǎng)基，獲得純培養(yǎng)物。將純培養(yǎng)物用超純水洗下后用于提取該細(xì)菌的總DNA。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的介紹的操作步驟提取DNA。提取的總DNA用于分離菌的PCR檢測(cè)。（2）分離菌16S rRNA基因PCR檢測(cè)及測(cè)序：引物采用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物，27F：5'-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3'；1541R：5'-AAGGAGGT GATCCAGCCGCA-3'，設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段為1514bp。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板1μl，2×Master Mix 20μl，上、下游引物個(gè)1μl，超純水17μl，震蕩混勻后，1000轉(zhuǎn)離心1min后放入PCR儀。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min。反應(yīng)結(jié)束，溫度降至4℃，直至取出。取5μL PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳。觀察有無特定的DNA片段出現(xiàn)。若有目標(biāo)片段出現(xiàn)，則將剩余的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的PCR產(chǎn)物序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中，用BLAST程序在線進(jìn)行基因序列相似性比對(duì)，搜索與PCR產(chǎn)物序列相同或相似的基因序列。

1.2.8 分離菌的生化試驗(yàn) 將分離菌的純培養(yǎng)物用革蘭氏陽性菌鑒定卡(梅里埃VITEK 2GP 21341)進(jìn)行生化特點(diǎn)檢測(cè)。按全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(型號(hào)：VITEK 2 compact system)的操作手冊(cè)進(jìn)行操作。

1.2.9 分離菌的藥物敏感性試驗(yàn) 無菌操作將分離菌的純培養(yǎng)物均勻涂布到鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，然后貼藥敏片。37℃培養(yǎng)18~24h。觀察并判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢及分離培養(yǎng)的結(jié)果

5只病狐肺臟觸片，染色后鏡檢，均發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性的單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀排列的球菌。5只病狐的肺臟分別接種亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基、Baird-parker培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基，均未見任何細(xì)菌生長(zhǎng)；但接種的血液瓊脂培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)出大小一致的表面光滑、有β溶血的小菌落。

2.2 犬瘟熱檢查的結(jié)果

5只病狐犬瘟熱檢查結(jié)果：對(duì)照線(C)均顯色，而檢測(cè)線(T)均不顯色。因此病狐未患犬瘟熱。

2.3 16S rRNA基因序列測(cè)定與比對(duì)

通過對(duì)分離菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)成功擴(kuò)增出約1500bp的條帶。將分離菌的16S rRNA基因的序列在NC BI數(shù)據(jù)庫中，用BLAST程序在線進(jìn)行基因序列相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該分離菌與登錄號(hào)為KP851852.1序列同源性為99%，因此確定該菌為犬鏈球菌(Streptococcus canis,S.canis)，命名為犬鏈球菌WF1。

附圖 分離菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳

2.4 分離菌的生化試驗(yàn)結(jié)果 該株犬鏈球菌WF1的生化特點(diǎn)見表1。

2.5 藥物敏感性試驗(yàn) 頭孢呋辛、林可霉素、四環(huán)素、慶大霉素、青霉素和頭孢唑林不敏感，美羅培南、頭孢吡肟敏感。具體見表2。

3 討論

（1）犬鏈球菌(Streptococcus canis,S.canis)可感染犬、貓、牛和水貂等多種動(dòng)物，導(dǎo)致被感染動(dòng)物乳房炎、流產(chǎn)、陰道炎等[1]。這次從發(fā)生肺炎的藍(lán)狐肺臟中只分離到犬鏈球菌WF1，沒有分離到能導(dǎo)致藍(lán)狐肺炎的多殺性巴氏桿菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌[2]、綠膿桿菌等常見病原菌，也未檢測(cè)到犬瘟熱病毒。說明犬鏈球菌是導(dǎo)致本次藍(lán)狐肺炎的致病菌。（2）犬鏈球菌導(dǎo)致的藍(lán)狐肺炎多見于埋植褪黑激素的當(dāng)年幼狐，發(fā)病時(shí)間多為每年的8~9月份，這與藍(lán)狐養(yǎng)殖場(chǎng)未控制好藍(lán)狐養(yǎng)殖舍的溫度有關(guān)。這時(shí)山東的天氣多炎熱，藍(lán)狐體內(nèi)的熱量由于通風(fēng)不良、周圍環(huán)境溫度高和缺少汗腺等原因在體內(nèi)積聚，導(dǎo)致嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激，從而使藍(lán)狐抗病力下降。這是誘發(fā)藍(lán)狐肺炎的重要誘因。（3）發(fā)生肺炎的該藍(lán)狐養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖條件簡(jiǎn)陋，蒼蠅滋生嚴(yán)重，而蒼蠅能傳播多種疾病[3]。在藍(lán)狐肺炎發(fā)生后，蒼蠅不斷地接觸病狐的排泄物和分泌物，往返于病狐和健康狐之間，促進(jìn)了犬鏈球菌的擴(kuò)散蔓延，加重了疫情。因此藍(lán)狐養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)經(jīng)常滅蠅，并積極采取防止蒼蠅滋生的措施，比如糞便每天清理，堆積發(fā)酵；食槽每天清洗，剩食及時(shí)處理；飼料加工的場(chǎng)所防止蒼蠅進(jìn)入。（4）藍(lán)狐養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)注意廠址的選擇。建場(chǎng)時(shí)應(yīng)遠(yuǎn)離村莊和其他毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)，以利于隔離飼養(yǎng)，減少藍(lán)狐肺炎發(fā)生后的急劇蔓延。藍(lán)狐飼養(yǎng)應(yīng)提升養(yǎng)殖模式，藍(lán)狐舍應(yīng)建成保溫棚舍，地面用水泥硬化，以提高消毒效果。每逢8~9月份，可使用風(fēng)機(jī)濕簾等降溫設(shè)施，減少熱應(yīng)激對(duì)藍(lán)狐的危害。（5）如果藍(lán)狐飼養(yǎng)場(chǎng)在藍(lán)狐發(fā)病后頻繁用藥，易導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)。本次分離到的犬鏈球菌WF1對(duì)四環(huán)素、慶大霉素和青霉素等多種抗菌藥耐藥，只對(duì)美羅培南等少數(shù)抗菌藥敏感，是一個(gè)值得注意的信號(hào)。因此加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，規(guī)范藍(lán)狐養(yǎng)殖用藥，推廣藥敏試驗(yàn)，這對(duì)減少犬鏈球菌的耐藥性具有重要的意義。

表1 犬鏈球菌WF1的生化特點(diǎn)

表2 藥物敏感性試驗(yàn) (mm)

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（2019–04–13）

濰坊市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)2014GX069.

山東部分地區(qū)毛皮動(dòng)物肺炎流行病學(xué)調(diào)查及防治技術(shù)研究

S852.61+1

A

1007-1733(2019)07-0007-03