周 燁,劉哲益,王方軍*

(1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

蛋白質(zhì)是生命體遺傳信息的翻譯產(chǎn)物和生物學(xué)功能的主要承擔(dān)者,催化和控制生物體內(nèi)幾乎所有過(guò)程。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是對(duì)生命體內(nèi)的全套蛋白質(zhì)進(jìn)行規(guī)?；到y(tǒng)分析的新興學(xué)科,其研究范圍不僅包括蛋白質(zhì)的規(guī)?；ㄐ院投?還包括蛋白質(zhì)的翻譯后修飾、相互作用、結(jié)構(gòu)和功能研究。蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的實(shí)現(xiàn)與其空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān),蛋白質(zhì)功能的調(diào)控也主要依賴(lài)于其構(gòu)象和相互作用的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié);對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),也是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要發(fā)展方向[1,2]。

自從20世紀(jì)50年代后期第一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被解析以來(lái)[3],全世界已經(jīng)有46 000多個(gè)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)被成功解析,極大促進(jìn)了蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的闡釋和后續(xù)靶向調(diào)節(jié)試劑的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)。解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的常規(guī)方法包括X射線晶體衍射(X-ray crystallography,XRD)技術(shù)[4]、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技術(shù)[5]和冷凍電鏡(cryo-electron microscope,cryo-EM)技術(shù)[6]。XRD只能提供蛋白質(zhì)的靜態(tài)結(jié)構(gòu)信息;NMR雖然能夠監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象變化,但是通常只能用于30 kDa以下的蛋白質(zhì);近年來(lái),cryo-EM發(fā)展迅速,已經(jīng)成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析的主流方法,但是儀器設(shè)備價(jià)格較為昂貴。此外,以上3種方法對(duì)蛋白質(zhì)樣品的純度和用量要求較高,樣品制備難度較大。

20世紀(jì)80年代,Tanaka[7]和Fenn[8]分別發(fā)展了基質(zhì)輔助激光解吸離子化(matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI)和電噴霧離子化(electrospray ionization,ESI)新方法,拓展了質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)在分析肽段和蛋白質(zhì)等熱不穩(wěn)定、難揮發(fā)的大分子中的應(yīng)用,引發(fā)了質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)的革命,蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)入了以質(zhì)譜為核心分析平臺(tái)的新階段。質(zhì)譜具有高精度、高靈敏度、高通量的特點(diǎn),能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品的規(guī)模化分析鑒定。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法已經(jīng)被越來(lái)越多地應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用和結(jié)構(gòu)分析,其特點(diǎn)是不受蛋白質(zhì)尺寸和純度的限制,可以進(jìn)行高通量動(dòng)態(tài)分析。常用的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法包括基于整體活性蛋白質(zhì)分析的非變性質(zhì)譜分析方法和基于酶解肽段分析的限制性蛋白質(zhì)酶切法、化學(xué)交聯(lián)法、氫氘交換法、共價(jià)化學(xué)標(biāo)記法等方法。隨著這些新方法的不斷進(jìn)步,結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)在近年來(lái)取得了快速發(fā)展,在蛋白質(zhì)組成和構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化分析、小分子藥物-蛋白質(zhì)識(shí)別機(jī)制研究等方面有著越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

本綜述將簡(jiǎn)要概述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的經(jīng)典方法,并重點(diǎn)討論近年來(lái)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)新方法的發(fā)展和應(yīng)用情況,最后對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)的未來(lái)發(fā)展進(jìn)行總結(jié)與展望。

1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析常規(guī)方法

1958年,歷史上第一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)誕生,Kendrew等[3]通過(guò)X射線晶體衍射法測(cè)定了肌紅蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu),X射線晶體衍射技術(shù)隨之成為確定原子水平蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的經(jīng)典方法。當(dāng)X射線照射蛋白質(zhì)時(shí),射線被蛋白質(zhì)分子中的電子散射,記錄為衍射圖案從而獲得電子密度圖,從中可分析獲得原子位置和化學(xué)鍵的信息,得到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。由于X射線對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)分子的衍射能力非常弱,因此需要通過(guò)蛋白質(zhì)晶體來(lái)實(shí)現(xiàn)探測(cè)信號(hào)的擴(kuò)增,這也限制了X射線晶體衍射技術(shù)的高通量應(yīng)用。蛋白質(zhì)結(jié)晶通常非常耗時(shí),需要測(cè)試多達(dá)數(shù)百個(gè)結(jié)晶條件,而且對(duì)蛋白質(zhì)樣品的純度要求非常高。整合膜蛋白質(zhì)、大分子復(fù)合物、無(wú)序蛋白質(zhì)和多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)等很難得到結(jié)晶。此外,該方法僅得到蛋白質(zhì)單一構(gòu)象的靜態(tài)結(jié)構(gòu)信息,與溶液中蛋白質(zhì)的活性動(dòng)態(tài)構(gòu)象可能有不一致的情況。

1985年,Wüthrich等[9]首次將核磁共振技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定,得到了公牛精漿的蛋白酶抑制劑IIA的結(jié)構(gòu)。在NMR實(shí)驗(yàn)中,需要將溶液中的蛋白質(zhì)置于強(qiáng)磁場(chǎng)中,通過(guò)發(fā)送特定頻率的電磁波,使蛋白質(zhì)中原子核與電磁波發(fā)生共振。核磁共振時(shí),由于蛋白質(zhì)原子所處的化學(xué)環(huán)境不同,原子核吸收的電磁波能量也不同,產(chǎn)生不同的共振譜信號(hào)。通過(guò)不同原子的化學(xué)位移(1H或13C),可以重建原子之間的化學(xué)聯(lián)系,從而得到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息[10]。與X射線晶體衍射相比,NMR的主要特點(diǎn)是分析在溶液狀態(tài)的活性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),可以監(jiān)測(cè)不同蛋白質(zhì)構(gòu)象間的動(dòng)態(tài)變化,是理解與蛋白質(zhì)功能密切相關(guān)的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)的有效手段[11]。然而,NMR需要進(jìn)行蛋白質(zhì)同位素標(biāo)記(如15N、13C),樣品純度和用量要求較高(mmol/L級(jí))[12],而且對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物研究困難[13]。

近年來(lái),隨著冷凍電鏡技術(shù)的快速進(jìn)步,能夠直接對(duì)液體、半液體的生物分子進(jìn)行高分辨率結(jié)構(gòu)測(cè)定。具體方法是,將蛋白質(zhì)樣品快速冷凍,使其玻璃態(tài)化,然后通過(guò)冷凍傳輸系統(tǒng)放入顯微鏡觀察,通過(guò)計(jì)算機(jī)提取和重構(gòu)軟件等處理得到圖像,生成準(zhǔn)確、詳細(xì)的亞細(xì)胞和分子級(jí)復(fù)雜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3D模型[14]。2013年,程亦凡等[15,16]利用冷凍電鏡技術(shù)首次獲得了300 kD膜蛋白TRPV1的0.34 nm分辨率的三維結(jié)構(gòu),并建立了該分子的原子模型。自此,冷凍電鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域蓬勃發(fā)展。冷凍電鏡的研究對(duì)象十分廣泛,從細(xì)胞、細(xì)胞器到超大蛋白質(zhì)復(fù)合物,均能夠進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。例如核孔復(fù)合體(nuclear pore complex,NPC)是生物體內(nèi)最復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)合體之一,它由30多種不同的蛋白質(zhì)亞基構(gòu)成,Eibauer等[17]利用冷凍電鏡技術(shù)成功解析了該復(fù)合體的精細(xì)結(jié)構(gòu),并提出了核孔控制大分子物質(zhì)出入的新模型。雖然冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展極大加速了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析速率,但還存在價(jià)格昂貴、維護(hù)成本高、對(duì)樣品的純度和用量要求較高、表征通量低的不足。

2 非變性蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析方法

近年來(lái)一系列基于質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法得到快速發(fā)展,表1簡(jiǎn)要總結(jié)了各種分析方法的優(yōu)點(diǎn)和局限。其中針對(duì)非變性整體蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析方法能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行直接表征,其分析目標(biāo)包括10～20 kDa的小相對(duì)分子質(zhì)量完整組蛋白,150 kDa的大相對(duì)分子質(zhì)量抗體,以及500～20 000 kDa的細(xì)胞機(jī)器(如蛋白酶體、核糖體、甚至是完整的病毒組裝體[18,19])。

表1 不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)Table1 Advantages and limitations of the main structural proteomics methods

2.1 非變性質(zhì)譜法

隨著高分辨、高質(zhì)量檢測(cè)范圍質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,非變性質(zhì)譜法(native MS)能夠?qū)钚誀顟B(tài)下的完整蛋白質(zhì)、非共價(jià)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用復(fù)合物和蛋白質(zhì)-受體復(fù)合物進(jìn)行直接研究[20]。非變性質(zhì)譜需要使用與ESI-MS兼容的揮發(fā)性緩沖液,例如乙酸銨緩沖液,濃度范圍為5 mmol/L至1 mol/L、中性pH,在此分析條件下通?？梢员３值鞍踪|(zhì)的活性結(jié)構(gòu)[21]。通過(guò)高分辨質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物精確相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定,可以直接確認(rèn)復(fù)合物的組成形式、亞基之間的化學(xué)計(jì)量關(guān)系、解離常數(shù)等。非變性質(zhì)譜法還可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的變體、翻譯后修飾(PTMs)以及電荷分布情況。Loo等[22]利用非變性質(zhì)譜表征嗜熱鏈球菌和兔的20S蛋白酶體(20S proteasome),證實(shí)了192 kDa的α7環(huán)結(jié)構(gòu)和完整的690 kDa的α7β7β7α7的化學(xué)計(jì)量關(guān)系,發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物蛋白酶體具有比細(xì)菌蛋白酶體更高的異質(zhì)性。Heck等[23]使用高分辨率、高精度質(zhì)譜分析激酶Plk1及其共激活因子Aurora激酶A(Aur-A)和Bora的多位點(diǎn)磷酸化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)Aur-A/Bora介導(dǎo)的Plk1激活伴隨著Aur-A/Bora和Plk1/Bora異二聚體的形成;同時(shí)Aur-A/Bora的相互作用獨(dú)立于Bora的磷酸化過(guò)程,而Plk1/Bora的相互作用依賴(lài)于Bora的多位點(diǎn)磷酸化。近年來(lái),非變性質(zhì)譜越來(lái)越多地用于研究蛋白質(zhì)非共價(jià)相互作用,在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能和組裝動(dòng)力學(xué)方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。

2.2 離子遷移質(zhì)譜

離子遷移質(zhì)譜(ion mobility MS)是在質(zhì)譜檢測(cè)器前端添加離子遷移管,通過(guò)檢測(cè)活性蛋白質(zhì)在氣相遷移過(guò)程中氣體碰撞截面的差異監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的差異和構(gòu)象變化[24,25],包括檢測(cè)相同蛋白質(zhì)的不同構(gòu)象異構(gòu)體[26]和蛋白質(zhì)的不同寡聚狀態(tài)[27]。具有相同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)在不同構(gòu)象或聚集狀態(tài)下,由于電荷數(shù)和體積大小不同,碰撞截面不同,從而具有不同的離子遷移率[28]。因此,IMS檢測(cè)到的離子遷移率的變化能夠解釋結(jié)構(gòu)變化信息,例如Marcoux等[29]利用IMS檢測(cè)配體誘導(dǎo)的ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P糖蛋白的構(gòu)象變化;Uetrecht等[30]通過(guò)IMS表征諾如病毒的組裝過(guò)程。

針對(duì)活性整體蛋白質(zhì)的非變性質(zhì)譜法目前主要分析對(duì)象還是相對(duì)分子質(zhì)量較小(<150 kDa)的水溶性蛋白質(zhì),對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較大、疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)如膜蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的分析仍然非常困難,需要對(duì)緩沖體系組成(表面活性劑和緩沖鹽的種類(lèi)、濃度等)、儀器檢測(cè)參數(shù)等進(jìn)行深入優(yōu)化。

3 基于酶切肽段的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法

以酶切肽段為分析對(duì)象的“自下而上”蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法在鑒定蛋白質(zhì)序列和修飾方面具有巨大的優(yōu)勢(shì),不僅是蛋白質(zhì)組學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)工作流程,還可以通過(guò)結(jié)合溶液內(nèi)的化學(xué)或酶促修飾手段在肽段水平上探測(cè)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和相互作用。其中,最常用的方法包括限制性蛋白質(zhì)酶切、化學(xué)交聯(lián)、氫氘交換、共價(jià)化學(xué)標(biāo)記和熱穩(wěn)定性法等。這些方法具有分析靈敏度高、通量高、不受蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量限制、樣品用量少和純度要求低等特點(diǎn),已經(jīng)引領(lǐng)了結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)分析的發(fā)展方向并且成為傳統(tǒng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方法的重要補(bǔ)充。

圖1 限制性蛋白質(zhì)酶切-質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)流程圖[32]Fig.1 Workflow of a LiP-MS experiment[32]Rel:Relative;int:intensity;RT:retention time.

3.1 限制性蛋白質(zhì)酶切

蛋白質(zhì)酶解在生物化學(xué)過(guò)程中具有重要作用,例如消化、分解代謝、蛋白質(zhì)成熟/活化、信號(hào)傳導(dǎo)等[31]。蛋白質(zhì)酶解的過(guò)程需要底物蛋白質(zhì)適應(yīng)蛋白酶活性位點(diǎn)的誘導(dǎo)機(jī)制形成水解反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)。當(dāng)活性蛋白質(zhì)區(qū)域結(jié)構(gòu)不能被蛋白酶識(shí)別,例如與小分子相互作用或發(fā)生了構(gòu)象變化時(shí),則該蛋白質(zhì)區(qū)域不能被蛋白酶完全水解,即產(chǎn)生限制性蛋白質(zhì)酶切(limited proteolysis,LiP)[32],其實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。因此,通過(guò)研究限制性酶切發(fā)生區(qū)域和效率差異可得到蛋白質(zhì)相關(guān)區(qū)域的結(jié)構(gòu)和相互作用信息。LiP實(shí)驗(yàn)主要包括在溶液條件下使用非特異性蛋白酶,如嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)或蛋白酶K(proteinase K),處理活性狀態(tài)下的蛋白質(zhì)樣品,并使用蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析方法測(cè)定酶切肽段含量變化[32],例如譜圖計(jì)數(shù)(spectra count)[33]、選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描(selective reaction monitoring,SRM)[33]、細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)[34]等定量方法。Picotti等[33,35]使用限制性酶切策略對(duì)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)不同生理狀態(tài)下結(jié)構(gòu)變化及其與小分子相互作用情況進(jìn)行高通量分析。當(dāng)小分子結(jié)合活性蛋白質(zhì)時(shí)阻礙了蛋白酶K水解相互作用的區(qū)域,降低了該區(qū)域蛋白酶解效率。隨后將蛋白質(zhì)變性并用胰蛋白酶充分酶解,通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析推斷蛋白質(zhì)與小分子的相互作用區(qū)域。通過(guò)此方法,Picotti等[35]發(fā)現(xiàn)了檸檬酸鹽和激酶Ppc間的相互作用,并通過(guò)體外酶活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)證實(shí)檸檬酸鹽對(duì)Ppc的抑制作用;同時(shí)發(fā)現(xiàn)了磷酸烯醇丙酮酸鹽、檸檬酸鹽和鳥(niǎo)苷三磷酸與激酶PfkB存在相互作用,并將其應(yīng)用于鑒定新的酶-底物關(guān)系。限制性蛋白質(zhì)酶切策略可以應(yīng)用在規(guī)?；治龅鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)改變、鑒定結(jié)構(gòu)變化的特定區(qū)域、蛋白質(zhì)聚集分析、目標(biāo)蛋白質(zhì)的靶向分析等方面,但是該方法對(duì)酶解條件的控制要求較為嚴(yán)格,結(jié)構(gòu)分辨率不高,并且對(duì)膜蛋白質(zhì)和復(fù)雜樣品中的低豐度蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)檢測(cè)仍存在較大困難。

3.2 化學(xué)交聯(lián)法

化學(xué)交聯(lián)法(chemical cross-linking MS,CXMS)能夠用于分析蛋白質(zhì)構(gòu)象、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白質(zhì)-核酸相互作用,是近年來(lái)迅速發(fā)展的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)新興方法[36]?；瘜W(xué)交聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)流程如圖2所示,使用特定長(zhǎng)度的化學(xué)交聯(lián)劑共價(jià)連接單個(gè)蛋白質(zhì)之內(nèi)或不同蛋白質(zhì)之間的功能基團(tuán),再對(duì)交聯(lián)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行酶切和蛋白質(zhì)組學(xué)分析,并利用專(zhuān)業(yè)的交聯(lián)數(shù)據(jù)處理軟件鑒定交聯(lián)位點(diǎn)。最常用的交聯(lián)試劑可與氨基酸側(cè)鏈的氨基或蛋白質(zhì)N端的氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),主要有二(磺基琥珀酰亞胺)辛二酸酯(bissulfosuccinimidyl suberate,BS3)、辛二酸二琥珀酰亞胺(disuccinimidyl suberate,DSS)、二(磺基琥珀酸亞酰胺)戊二酸酯(bissulfosuccinimidyl glutarate,BS2G)和雙琥珀酰亞胺戊二酸酯(disuccinimidyl glutarate,DSG)。由于交聯(lián)試劑兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)之間的臂長(zhǎng)限制,只有在空間距離上足夠近的兩個(gè)氨基酸才有可能被共價(jià)連接起來(lái)。通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定這些交聯(lián)位點(diǎn),能夠初步確定交聯(lián)蛋白質(zhì)位點(diǎn)間的空間距離,從而提供一種低精度的結(jié)構(gòu)信息[37]。Erzberger等[38]通過(guò)化學(xué)交聯(lián)策略建立了翻譯起始復(fù)合體40S·EIF1·eIF3的結(jié)構(gòu)模型,并確定了真核起始因子EIF3a的C端結(jié)構(gòu)域在核糖體40S上的位置。北京生命科學(xué)研究所董夢(mèng)秋團(tuán)隊(duì)與中科院計(jì)算所賀思敏團(tuán)隊(duì)[39]于2012年合作開(kāi)發(fā)了化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件pLink,并應(yīng)用于大腸桿菌蛋白質(zhì)組樣品交聯(lián)結(jié)果的分析,目前該軟件可以進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)合物和復(fù)雜樣品大規(guī)模交聯(lián)數(shù)據(jù)的解析。

圖2 化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)流程圖[40]Fig.2 Workflow of a chemical cross-linking MS (CXMS)experiment[40]

近年來(lái),化學(xué)交聯(lián)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)方法不斷發(fā)展和改進(jìn)。酶解后的肽段在進(jìn)入質(zhì)譜分析之前,往往會(huì)采用富集或分離的手段(如體積排阻色譜[41]、離子交換色譜[42]、親和標(biāo)簽富集[43,44]等)降低樣品的復(fù)雜程度以提高后續(xù)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)處理的準(zhǔn)確性和通量。體內(nèi)化學(xué)交聯(lián)也越來(lái)越多地應(yīng)用于研究活性細(xì)胞環(huán)境中的蛋白質(zhì)相互作用[45,46]。新型交聯(lián)劑的使用,如光反應(yīng)性交聯(lián)劑SDAD(succinimidyl 2-((4,4′-azipentanamido)ethyl)-1,3′-dithiopropionate)[47]和可碎裂交聯(lián)劑DSBU(disuccinimidyl dibutyric urea)[48],顯著提高了交聯(lián)肽段的質(zhì)譜鑒定效率和可信度,使得該技術(shù)得到了更廣泛的應(yīng)用。

3.3 氫氘交換法

圖3 氫氘交換質(zhì)譜法實(shí)驗(yàn)的基本步驟[52]Fig.3 General steps of the hydrogen-deuterium exchange(HDX)-MS experiment[52]ESIMS:electrospray ionization mass spectrometry;ETD:electron transfer dissociation.

氫氘交換法(hydrogen-deuterium exchange,HDX)作為探測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的手段在20世紀(jì)70年代初引入,是最廣泛使用的方法之一[49]。氫氘交換法將活性蛋白質(zhì)骨架酰氨基的活潑氫原子置換為氘代溶劑(D2O、CH3OD等)中的氘原子,并通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測(cè)酶解肽段質(zhì)量偏移確定發(fā)生氫氘交換蛋白質(zhì)區(qū)域[50]。一般暴露在外側(cè)、與溶劑密切接觸的蛋白質(zhì)骨架酰氨基氫原子容易發(fā)生氫氘交換,比位于蛋白質(zhì)內(nèi)部或參與氫鍵形成的氫原子交換速率更快。氫氘交換的速率可以揭示溶劑中氘原子進(jìn)入蛋白質(zhì)特定區(qū)域能力的強(qiáng)弱,根據(jù)交換速率的不同和變化可以監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化[51]。此外,氫氘交換法還能夠提供蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)以及翻譯后修飾引起的構(gòu)象變化信息。氫氘交換法基本步驟如圖3所示,將蛋白質(zhì)樣品從H2O轉(zhuǎn)移到基于D2O的緩沖液中,實(shí)現(xiàn)氘代標(biāo)記;然后在不同時(shí)間點(diǎn)酸化和冷卻溶劑以淬滅該交換反應(yīng);最后對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,獲得不同肽段區(qū)域發(fā)生氫氘交換的程度異同,揭示蛋白質(zhì)的溶劑可接觸區(qū)域及結(jié)構(gòu)變化情況。

目前氫氘交換法越來(lái)越多地應(yīng)用在膜蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方面,揭示膜受體的相互作用[53,54]、膜蛋白質(zhì)的構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化[55]或蛋白質(zhì)-膜相互作用[56]。此外,氫氘交換法是研究伴侶蛋白與底物相互作用的一種有效方法。區(qū)分特異和非特異性的伴侶蛋白-底物相互作用和底物內(nèi)相互作用難度較大,并且相關(guān)相互作用在底物折疊過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化,進(jìn)一步增加了相關(guān)研究的難度。D’Arcy等[57]利用氫氘交換法表征了組蛋白H2A-H2B異二聚體與其伴侶蛋白Nap1之間的相互作用,證實(shí)了Nap1可以限制H2A-H2B的構(gòu)象多變性,將其部分無(wú)序的組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)變?yōu)楦行蛘郫B的構(gòu)象。同時(shí)他們繪制了Nap1/H2A-H2B的結(jié)合界面,揭示了Nap1和H2A-H2B內(nèi)的協(xié)同解折疊現(xiàn)象。氫氘交換法是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和相互作用動(dòng)力學(xué)的有效工具,其缺點(diǎn)主要是在樣品酶解、色譜分離、質(zhì)譜離子化等過(guò)程中存在氫氘回交現(xiàn)象,需要對(duì)樣品預(yù)處理和色譜分離等條件嚴(yán)格控制,如保持溫度和低pH等,降低了色譜分離分辨率和質(zhì)譜分析性能[50]。

3.4 共價(jià)化學(xué)標(biāo)記

共價(jià)化學(xué)標(biāo)記(covalent labeling)與HDX類(lèi)似,利用蛋白質(zhì)上活性基團(tuán)的反應(yīng)性差異來(lái)揭示結(jié)構(gòu)信息。HDX主要通過(guò)探測(cè)酰胺骨架位點(diǎn)的反應(yīng)性來(lái)監(jiān)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)水平的動(dòng)力學(xué)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),而共價(jià)化學(xué)標(biāo)記技術(shù)通過(guò)對(duì)氨基酸側(cè)鏈活性基團(tuán)進(jìn)行修飾(如氧化、乙?；㈢牾；?提供反應(yīng)性的相關(guān)信息。溶劑暴露區(qū)域的氨基酸容易與共價(jià)標(biāo)記試劑反應(yīng),而由于蛋白質(zhì)相互作用或構(gòu)象變化導(dǎo)致埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸被“保護(hù)”起來(lái),難以進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)[58]。基于這種反應(yīng)性的差異,利用蛋白質(zhì)組學(xué)高通量分析蛋白質(zhì)標(biāo)記發(fā)生區(qū)域及其標(biāo)記程度,即可得到相關(guān)結(jié)構(gòu)信息。

羥基自由基足跡法(hydroxyl-radical footprinting,HRF)是一種廣泛使用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析共價(jià)標(biāo)記方法,該方法利用羥基自由基氧化修飾蛋白質(zhì)中溶劑可接觸的氨基酸位點(diǎn)。有17種氨基酸的側(cè)鏈可被羥基自由基氧化,其中巰基側(cè)鏈最容易發(fā)生反應(yīng),其次是芳香族和脂肪族側(cè)鏈[1]。羥基自由基可以通過(guò)多種物理或化學(xué)方法產(chǎn)生,包括高能同步輻射[59]、γ射線輻射[60]、脈沖電子束[61]和電化學(xué)流動(dòng)池[62]等。此外,還可以通過(guò)紫外激光光解過(guò)氧化氫產(chǎn)生羥基自由基,這種技術(shù)通常被稱(chēng)為蛋白質(zhì)的快速光化學(xué)氧化(fast photochemical oxidation of proteins,FPOP)[63]。Vahidi等[64]利用FPOP考察了不同時(shí)間點(diǎn)的肌紅蛋白在折疊期間的氧化修飾,揭示了不同時(shí)間點(diǎn)不同蛋白質(zhì)區(qū)域的氧化程度,結(jié)果表明肌紅蛋白的折疊由疏水側(cè)鏈的相互作用引起,如圖4所示。由于溶劑可接觸性是HRF法的主要決定因素,因此當(dāng)配體結(jié)合或不同生物狀態(tài)誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化引起溶劑可接觸性改變時(shí),可利用HRF鑒定相互作用位點(diǎn)和構(gòu)象變化的區(qū)域[65]。該方法也可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物[60],內(nèi)在膜蛋白(integral membrane proteins,IMP)結(jié)合研究[66],并可用于細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)[67]。然而,HRF的氧化特異性不高,對(duì)不同氨基酸氧化效率差異可達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)[59]。此外,利用物理法產(chǎn)生羥基自由基需要昂貴的設(shè)備,不易推廣;而基于過(guò)氧化氫的FPOP方法和其他化學(xué)催化方法需要額外加入特定試劑,可能引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化從而影響分析結(jié)果。

圖4 通過(guò)FPOP測(cè)量肌紅蛋白折疊期間的結(jié)構(gòu)變化[64]Fig.4 Structural changes during apo-myoglobin foldingas measured by FPOP(fast photochemical oxidation of proteins)[64]A-H:helix chains of apo-myoglobin;ox:oxidation;t:time.

其他共價(jià)標(biāo)記的方法利用特定化學(xué)試劑對(duì)蛋白質(zhì)表面的氨基酸進(jìn)行修飾,通過(guò)氨基酸反應(yīng)性檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。不同于HRF中羥基自由基需要專(zhuān)門(mén)設(shè)備產(chǎn)生,化學(xué)試劑直接添加到蛋白質(zhì)溶液中進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。標(biāo)記試劑可以分為兩類(lèi),包括氨基酸特異性標(biāo)記與非特異性標(biāo)記。例如,二乙基焦碳酸酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)是一種非特異性的標(biāo)記試劑,可通過(guò)親核取代反應(yīng)修飾多種親核殘基(半胱氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸)的側(cè)鏈和蛋白質(zhì)的N端[68,69]。然而,一些修飾的殘基,特別是絲氨酸和蘇氨酸,在溶液中保留太久會(huì)發(fā)生水解,導(dǎo)致標(biāo)記丟失,因此必須在標(biāo)記反應(yīng)完成后立即酶解和質(zhì)譜分析[70]。TMT(tandem mass tag)基于琥珀酰亞胺基團(tuán)可以特異性修飾賴(lài)氨酸側(cè)鏈和蛋白質(zhì)N端,根據(jù)標(biāo)記反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)信息可以獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息[71]。此外,Cravatt課題組[72]設(shè)計(jì)了基于活性分子探針的蛋白質(zhì)標(biāo)記方法(activity-based protein profiling,ABPP)。活性分子探針由報(bào)告基團(tuán)、反應(yīng)基團(tuán)和將二者相連的聚乙二醇鏈或者碳鏈組成,報(bào)告基團(tuán)可以是生物素基團(tuán)、熒光基團(tuán)或者是便于引入新的化合物的正交反應(yīng)基團(tuán)等,反應(yīng)基團(tuán)一般是親電小分子,用于選擇性結(jié)合蛋白酶的活性中心并與具有重要催化功能的親和氨基酸反應(yīng),從而將分子探針共價(jià)標(biāo)記到蛋白質(zhì)上[73]。Cravatt課題組[74,75]將該方法應(yīng)用于人體細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)中半胱氨酸和賴(lài)氨酸的規(guī)?；b定,將活性分子探針作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑直接加入蛋白質(zhì)組,從而定位靶標(biāo)蛋白質(zhì)和靶點(diǎn),為小分子與蛋白質(zhì)的相互作用、抑制劑的設(shè)計(jì)等提供指導(dǎo)。

目前常用的共價(jià)標(biāo)記方法主要針對(duì)賴(lài)氨酸上的伯氨基團(tuán)和半胱氨酸上的巰基,相關(guān)標(biāo)記反應(yīng)如琥珀?；瓤赡芤鸬鞍踪|(zhì)電荷、疏水性、結(jié)構(gòu)的改變從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活[76,77]。此外,目前常用的標(biāo)記反應(yīng)試劑的物理化學(xué)性質(zhì)較為復(fù)雜、尺寸較大、空間位置效應(yīng)明顯,只能探測(cè)蛋白質(zhì)暴露于溶劑且沒(méi)有較大位阻的區(qū)域,對(duì)于一些有較大位阻的蛋白質(zhì)活性中心區(qū)域的結(jié)構(gòu)變化難以探測(cè)。因此,基于共價(jià)化學(xué)標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)構(gòu)分析方法目前仍面臨挑戰(zhàn),亟須發(fā)展一種不改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物活性的共價(jià)化學(xué)標(biāo)記策略,同時(shí)降低標(biāo)記試劑尺寸和空間位阻效應(yīng),使其可以探測(cè)蛋白質(zhì)中位阻較大的活性中心區(qū)域,從而提高結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)分析的準(zhǔn)確性。本課題組[78]發(fā)展了一種活性蛋白質(zhì)二甲基化標(biāo)記新方法用于研究膜蛋白質(zhì)復(fù)合物中賴(lài)氨酸的反應(yīng)性及其近程微環(huán)境(lysine proximal microenvironment,LPM)。由于標(biāo)記試劑相對(duì)分子質(zhì)量小(CH2O和NaBH3CN),能對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物中的幾乎全部賴(lài)氨酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)特異性差異標(biāo)記;并且該反應(yīng)不影響蛋白質(zhì)電荷情況,在標(biāo)記后蛋白質(zhì)仍然能夠保持生物學(xué)活性,實(shí)現(xiàn)了超大相對(duì)分子質(zhì)量膜蛋白質(zhì)復(fù)合物(700 kDa)中賴(lài)氨酸反應(yīng)活性和近程微環(huán)境的高通量、全面分析。此外,本課題組[79]將該方法進(jìn)一步應(yīng)用于小分子配體對(duì)蛋白質(zhì)受體的分子識(shí)別和結(jié)構(gòu)調(diào)控機(jī)制解析,如圖5所示,通過(guò)可視化賴(lài)氨酸反應(yīng)性的變化值監(jiān)測(cè)膜受體蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)模式。相關(guān)結(jié)果證明,該方法不僅可以發(fā)現(xiàn)小分子與蛋白質(zhì)的直接作用界面區(qū)域,還可以監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)發(fā)生了誘導(dǎo)構(gòu)象變化的其他區(qū)域,為研究小分子配體的作用機(jī)制提供了一種全新的質(zhì)譜分析方法,有望應(yīng)用于靶向藥物的篩選、評(píng)估和優(yōu)化。

圖5 完整蛋白質(zhì)活性二甲基標(biāo)記示意圖[79]Fig.5 Schematic diagram of the active dimethyl labeling of intact proteins[79]

3.5 熱穩(wěn)定性分析法

圖6 蛋白質(zhì)組熱穩(wěn)定性高通量定量分析[81]Fig.6 Quantitative protein-wide profiling of protein thermal stability[81]TMT:tandem mass tag.

蛋白質(zhì)組的熱穩(wěn)定性分析法(thermal proteome profiling,TPP)可以通過(guò)分析蛋白質(zhì)不同構(gòu)象/結(jié)構(gòu)在高溫下穩(wěn)定性的差異高通量探測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。蛋白質(zhì)在高溫下會(huì)發(fā)生部分變性聚集,從而導(dǎo)致在溶液中的含量減少,在細(xì)胞裂解液中添加小分子藥物,通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析添加小分子前后蛋白質(zhì)在不同溫度下熱穩(wěn)定性的差異即可得到小分子藥物的潛在作用底物蛋白質(zhì)[80],見(jiàn)圖6。Savitski等[81]利用該方法系統(tǒng)分析了小分子配體的靶向蛋白質(zhì)底物,例如確定了激酶抑制劑staurosporine的50多個(gè)蛋白質(zhì)靶點(diǎn),如激酶PKN1 (protein kinase N1)和AURKA(aurora kinase A);觀察到過(guò)釩酸鹽誘導(dǎo)的T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)中的熱變化,影響ATP(adenosine triphosphate)結(jié)合膜蛋白ATP1A1和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MDR1(multidrug-resistance transporter)[82];揭示了組蛋白去乙?；敢种苿﹑anobinostat對(duì)苯丙氨酸羥化酶的抑制作用[83];同時(shí)將該方法應(yīng)用于蛋白質(zhì)降解與合成的動(dòng)態(tài)分析,例如揭示雷洛昔芬誘導(dǎo)雌激素受體TMEM97降解失調(diào),影響膽固醇體內(nèi)平衡調(diào)節(jié)劑等[84]。這種檢測(cè)熱穩(wěn)定性變化的方法能有效鑒定藥物的蛋白質(zhì)底物,有助于系統(tǒng)研究藥物功效和毒性。然而,該方法不能給出藥物與底物蛋白質(zhì)的具體結(jié)合位點(diǎn)和區(qū)域信息,不能用于小分子配體和底物蛋白質(zhì)的分子識(shí)別和作用機(jī)制研究。

4 展望

基于質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法是常規(guī)結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析(XRD、NMR和cryo-EM)的重要補(bǔ)充。其特點(diǎn)在于不受所分析蛋白質(zhì)樣品的純度、尺寸的限制,可以對(duì)復(fù)雜活性蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行高通量動(dòng)態(tài)分析,特別適合分析活性蛋白質(zhì)復(fù)合物在外界刺激如藥物小分子結(jié)合時(shí)的結(jié)構(gòu)/構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化分子機(jī)制。結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)分析在探索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和相互作用方面有著廣泛的應(yīng)用前景,通過(guò)新方法新技術(shù)的開(kāi)發(fā)有望將結(jié)構(gòu)生物學(xué)進(jìn)一步推向組學(xué)分析的新層次,能夠更為深入地探索復(fù)雜生物分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)和結(jié)構(gòu)/構(gòu)象協(xié)同分子機(jī)制,從而更好地闡釋各種生物學(xué)過(guò)程。要實(shí)現(xiàn)此目標(biāo),結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)分析還需要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行創(chuàng)新和發(fā)展,包括:(1)由于質(zhì)譜分析需要引入質(zhì)量標(biāo)簽,因此需要發(fā)展在細(xì)胞或動(dòng)物中進(jìn)行活體標(biāo)記的方法,包括新的標(biāo)記試劑和新的標(biāo)記反應(yīng),在不影響蛋白質(zhì)活性、結(jié)構(gòu)和生理狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系中蛋白質(zhì)特定氨基酸或某一類(lèi)氨基酸的高效標(biāo)記,通過(guò)標(biāo)記的蛋白質(zhì)區(qū)域和程度實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè);(2)在數(shù)據(jù)處理方面,需要在整合已有的X射線晶體衍射和電鏡結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上引入結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)分析數(shù)據(jù),從而模擬蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化分子機(jī)制以及與其他生物分子的相互作用情況;(3)高通量的液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,進(jìn)一步提高復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)分析的序列覆蓋率,實(shí)現(xiàn)組學(xué)層次上蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的全面動(dòng)態(tài)分析;(4)質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,實(shí)現(xiàn)復(fù)雜活性蛋白質(zhì)組樣品的直接質(zhì)譜分析,也就是目前逐漸引起關(guān)注的非變性整體蛋白質(zhì)組學(xué)分析(native top-down proteomics),這依賴(lài)于質(zhì)譜分辨率的提高、檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量范圍的擴(kuò)大、氣相解離技術(shù)的進(jìn)步以及對(duì)氣相反應(yīng)和解離機(jī)理與規(guī)律的進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)。

綜上所述,結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)分析的序幕已經(jīng)拉開(kāi),將成為化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)藥健康等多個(gè)領(lǐng)域交叉研究的熱點(diǎn)。相信在不久的將來(lái),基于質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)方法將在疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的功能分析和藥物篩選等方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。