謝唐貴 陳敬民 李燕婧 藍(lán)保強(qiáng) 蔣珍藕

(1 廣西中醫(yī)藥研究院藥理所，南寧市 530022，電子郵箱：505076561@qq.com；2 廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧市 530022；廣西中醫(yī)藥研究院3 制劑中心，4 中藥所，南寧市 530022)

鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛干燥莖，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，可治療陰虛火旺、胃陰不足、口干煩渴、熱病津傷、骨蒸勞熱、目暗不明等癥[1]。研究顯示，鐵皮石斛有祛疲勞、提高免疫力、保肝、降血糖和促進(jìn)消化等作用[2]，但目前尚無(wú)相關(guān)藥理作用與其化學(xué)成分之間的關(guān)聯(lián)性研究報(bào)道。近年來(lái)提出的“譜-效”分析研究[3]，是指應(yīng)用指紋圖譜和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析中藥的化學(xué)成分與其藥效的關(guān)系，是闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要手段之一。免疫調(diào)節(jié)是鐵皮石斛發(fā)揮滋陰功效的藥理作用之一。本文以免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力作為藥效考察指標(biāo)，以指紋圖譜表達(dá)鐵皮石斛物質(zhì)組分，采用偏最小二乘回歸法(partial least squares regression,PLSR)分析兩者間的關(guān)聯(lián)性，探討鐵皮石斛中具有增強(qiáng)免疫功能的物質(zhì)，為鐵皮石斛的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 主要儀器 LC-20AT型高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀以及Shim-pack VP-ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)均購(gòu)于島津公司， 1510型酶標(biāo)儀購(gòu)于Thermo Fisher公司。

1.2 藥材 鐵皮石斛的產(chǎn)地分別為廣西凌云縣、廣西容縣、廣西桂林市、云南文山，均經(jīng)本院中藥所鑒定為鐵皮石斛的干燥莖。

1.3 主要試劑 環(huán)磷酰胺(山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：04150102)，碳酸鈉(廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)：20150415)，甲醇(色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)：150515)，乙腈(色譜純，德國(guó)默克公司，批號(hào)：JA034130)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡昆明種小鼠100只，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002)，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 鐵皮石斛水提取物及醇提取物的制備 將鐵皮石斛粉碎為24目顆粒，加水(或乙醇)浸泡1 h，煎煮(或回流加熱)提取，1 h/次，共3次，合并提取液，過(guò)濾、濃縮、干燥成粉末，即得水(或醇)提取物。

2.2 供試品溶液的配制 精密稱取鐵皮石斛水(或醇)提取物適量，加50%甲醇(或100%甲醇)25 mL，稱定重量，回流加熱(或超聲處理，處理參數(shù)240 W、40 kHz、40℃)30 min，冷卻，用50%甲醇(或100%甲醇)補(bǔ)足重量，搖勻，4 000 r/min離心10 min，取上清液濾過(guò)，濾液即為供試品溶液。

2.3 藥效實(shí)驗(yàn)樣品配制 稱取水(或醇)提取物，蒸餾水溶解，配制成所需濃度。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件：色譜柱均為Shim-pack VP-ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。(1)水提取物：流動(dòng)相為甲醇(A)-水(B)。梯度洗脫：0～10 min,5%～12% A；10～30 min,12%～23% A；30～50 min,23%～5% A。體積流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為25℃。(2)醇提取物：流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)。梯度洗脫：0～10 min,8%～15% A；10～38 min,15%～28% A；38～50 min,28%～20% A；50～65 min,20%～8% A。體積流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm，柱溫為30℃。

2.4.2 方法學(xué)考察：依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典(2015年版四部)》[4]規(guī)定的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，指紋圖譜相似度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.2%，符合藥物分析要求。

2.4.3 HPLC指紋圖譜：按上述的色譜條件開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，記錄50～65 min HPLC圖；應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012.130723版本)軟件(時(shí)間窗為0.4，生成的色譜方法為平均值)，多點(diǎn)校正色譜峰后進(jìn)行匹配，形成各供試品的HPLC指紋圖譜。對(duì)各供試品各色譜峰的響應(yīng)值進(jìn)行綜合，將具有3個(gè)以上的共有峰或2個(gè)響應(yīng)值較大的共有峰作為特征色譜峰；并將各供試品進(jìn)樣量換算成mg生藥量，校正各特征色譜峰的峰面積，無(wú)色譜峰的對(duì)應(yīng)峰面積為0，共提取出30個(gè)特征色譜峰，見(jiàn)表1。

表1 各樣本色譜峰對(duì)應(yīng)的校正峰相對(duì)面積

2.5 鐵皮石斛對(duì)免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 將100只小鼠按隨機(jī)區(qū)組法分為正常組、模型組及8個(gè)樣品組，每組10只，按照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。各樣品組按1.633 g生藥/kg對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃給藥，正常組、模型組小鼠分別給予蒸餾水0.2 mL/10 g灌胃，1次/d，共10 d。除正常組外，其余各組小鼠分別于第3、7 d腹腔注射50 mg/kg環(huán)磷酰胺。末次給藥后1.5 h，各小鼠尾靜脈注射20%印度墨汁(生理鹽水稀釋)0.1 mL/10 g，注射后1 min(t1)及7 min(t2)，分別眼眶取血20 μL，溶于2 mL 0.1%碳酸鈉溶液中，搖勻，酶標(biāo)儀測(cè)定各血樣680 nm處的吸光度A值，計(jì)算廓清指數(shù)，廓清指數(shù)=(lgA1-lgA2)/(t2-t1)，其中A1、A2分別為對(duì)應(yīng)時(shí)間血樣的680 nm處的吸光度A值。結(jié)果顯示，模型組的廓清指數(shù)低于正常組(P<0.05)；與模型組比較，各水提取物樣品組小鼠的廓清指數(shù)升高(均P<0.05)，但各醇提取物樣品組小鼠的炭末廓清指數(shù)與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 8組小鼠廓清指數(shù)比較(n=10，x±s)

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.6 譜效分析 按照文獻(xiàn)[6]方法開(kāi)展炭末廊清指數(shù)與色譜峰間的譜效分析。廓清指數(shù)按(各提取物組-模型組)/(正常對(duì)照組-模型組)×100%進(jìn)行預(yù)處理。以預(yù)處理后的廓清指數(shù)作為因變量Y，各供試品特征峰的峰面積作為自變量X，采用SIMCA-P 13.0軟件的PLSR進(jìn)行譜效分析。經(jīng)軟件PLSR擬合，該模型標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)回歸方程為Y=(-3.78X1+4.21X2-2.61X3+5.91X4-4.74X5+5.91X6-9.82X7+5.61X8-3.80X9+6X10+1.73X11-1.62X12+6.12X13+5.62X14+5.21X15+3.85X16+5.75X17+5.49X18+4.4X19-3.2X20+6.72X21-3.48X22+5.45X23+1.17X24-0.73X25-2.44X26+4.84X27+4.21X28+0.4X29-3.53X30)×0.01 ，經(jīng)交叉驗(yàn)證方差分析,該譜效關(guān)系PLSR分析模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3；X相對(duì)于Y有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的回歸系數(shù)有21個(gè)色譜峰，見(jiàn)圖1。其中可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能的色譜峰為第4、6、8、10、11、14、15、17、18、21、23、27號(hào)，共12個(gè)。色譜峰UV標(biāo)準(zhǔn)化峰面積相對(duì)于廓清指數(shù)的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。

表3 色譜峰與廓清指數(shù)PLSR模型的相關(guān)系數(shù)

圖1 單位方差標(biāo)準(zhǔn)化色譜峰面積對(duì)廓清指數(shù)提高率的回歸系數(shù)及其95% CI

表4 色譜峰UV標(biāo)準(zhǔn)化峰面積相對(duì)于廓清指數(shù)的相關(guān)系數(shù)

3 討 論

中藥的藥效是多種化學(xué)成分共同作用的結(jié)果，某些化學(xué)成分與其藥效間存在著必然且緊密的聯(lián)系。PLSR是一種有廣泛適用性的多元統(tǒng)計(jì)方法，綜合了典型相關(guān)分析、主成分分析及多元線性回歸分析等多種統(tǒng)計(jì)分析的功能，可統(tǒng)計(jì)分析出因變量與自變量間的相關(guān)性、貢獻(xiàn)度，從而揭示中藥化學(xué)成分對(duì)藥效指標(biāo)的綜合作用，近年來(lái)常被應(yīng)用于中藥譜效關(guān)系研究。本研究采用PLSR分析鐵皮石斛的提取物與免疫低下小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能間的譜效關(guān)系，模型回歸系數(shù)的絕對(duì)值反映了色譜峰所代表物質(zhì)對(duì)廓清指數(shù)影響的貢獻(xiàn)強(qiáng)弱。該模型提取的兩個(gè)主成分對(duì)自變量X解釋能力(R2X)達(dá)到72.8%，對(duì)因變量Y的解釋能力(R2Y)和預(yù)測(cè)能力(Q2)分別達(dá)到99.3%和96.8%，表明PLSR模型有良好的解釋和預(yù)測(cè)作用。

廓清指數(shù)PLSR模型的正數(shù)回歸系數(shù)中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的有12個(gè)色譜峰，其中10個(gè)來(lái)源于水提取物，X13和X21色譜峰同時(shí)來(lái)源于水提物、醇提物，但水提物的色譜峰面積分別為醇提取物的15.79、9.10倍，由此可推斷，可增強(qiáng)機(jī)體單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的鐵皮石斛化學(xué)成分主要存在于水提取物中，其色譜峰分別為X4、X6、X8、X10、X13、X14、X15、X17、X18、X21、X23、X27。經(jīng)SPSS 23.0分析，X4、X8、X13等3個(gè)色譜峰UV標(biāo)準(zhǔn)化峰面積相對(duì)于Y的相關(guān)系數(shù)分別為0.953、0.919、0.931，具有極強(qiáng)相關(guān)性；X10、X14、X15、X18、X21、X23等6個(gè)色譜峰UV標(biāo)準(zhǔn)化峰面積相對(duì)于Y的相關(guān)系數(shù)分別為0.848、0.873、0.823、0.875、0.888、0.898，具有強(qiáng)相關(guān)性；其余3個(gè)色譜峰UV標(biāo)準(zhǔn)化峰面積相對(duì)于Y的偏相關(guān)系數(shù)在0.7～0.8之間，具有較強(qiáng)相關(guān)性。

模型擬合方程的負(fù)數(shù)回歸系數(shù)中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的有9個(gè)色譜峰，均來(lái)源于醇提取物，由此推斷，抑制機(jī)體單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的鐵皮石斛化學(xué)成分主要存在于醇提取物中，其色譜峰分別為X1、X3、X5、X7、X9、X20、X22、X26、X30。因鐵皮石斛化學(xué)成分類別眾多、成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，這些色譜峰，尤其是可增強(qiáng)機(jī)體單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的色譜峰，所對(duì)應(yīng)的具體化學(xué)成分有待進(jìn)一步研究確定。