蘇宏偉 劉軍超 李 婷 曹 娟 李 晨 劉 鑫 李向東

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1 泌尿外科，2 病理科，張家口市 075000,電子郵箱：suhwwww@sina.com；3 河北省張家口市第二醫(yī)院藥械科，張家口市 075000)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居泌尿系統(tǒng)腫瘤前列[1]。資料顯示，2016年全球膀胱癌的發(fā)病人數(shù)約43萬(wàn)，死亡人數(shù)約16.5萬(wàn)，其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類的生命安全[2]。盡管手術(shù)聯(lián)合放化療可以提高膀胱癌患者的總體生存率，但仍有部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其5年生存率仍較低[3]。膀胱癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響膀胱癌患者治療和預(yù)后的重要因素，因此，探討膀胱癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要意義。大量研究顯示[4-8]，T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(T-lymphoma invasion and metastasis-inducing factor 1，Tiam1)在多種腫瘤中呈高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)。然而，目前關(guān)于Tiam1在膀胱癌組織中表達(dá)的研究較少。本研究探討Tiam1在膀胱癌組織中的表達(dá)及其與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系，為膀胱癌的早期診斷、臨床治療及預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選擇2009年1月至2013年4月在我院泌尿外科住院手術(shù)治療的233例膀胱尿路上皮癌患者，收集其膀胱癌組織，其中男125例、女108例；年齡(57.4±6.7)歲；術(shù)后病理結(jié)果提示低級(jí)別尿路上皮癌127例，高級(jí)別尿路上皮癌106例；行膀胱部分切除術(shù)18例，膀胱根治性切除77例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均經(jīng)病理確診為膀胱尿路上皮癌；(2)均具有完整的臨床資料、病理資料及隨訪資料；(3)術(shù)前均未接受放療、化療(包括膀胱灌注)等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他器官惡性腫瘤；(2)曾行化療、放療，包括新輔助化療；(3)合并膀胱結(jié)石。膀胱癌組織標(biāo)本分為兩部分，一部分行常規(guī)蠟塊包埋，一部分于液氮中凍存。另取同期50例行恥骨上前列腺切除術(shù)的男性患者的正常膀胱組織為對(duì)照組，年齡(61.5±4.7)歲，正常膀胱組織存于液氮中冷凍備用。所有患者均常規(guī)膀胱鏡隨訪5～7年，2年內(nèi)每3個(gè)月復(fù)查1次，2年后每半年復(fù)查1次，5年后每年復(fù)查1次，記錄復(fù)發(fā)情況。本研究獲河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人Tiam1單克隆抗體(批號(hào)：sc-377355)、β-肌動(dòng)蛋白抗體(批號(hào)：sc-9996)、生物素標(biāo)記的二抗(鼠抗兔多克隆抗體，批號(hào)：sc-2004)均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。免疫組化試劑盒(批號(hào)：PV-9000)購(gòu)于北京中杉金橋公司。引物設(shè)計(jì)由上海生工生物工程有限公司提供。PCR試劑盒(批號(hào)：4472908)、總RNA提取試劑盒(批號(hào)：15596-018)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：k1622)購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。Bio-Rad iMark型酶標(biāo)儀、Bio-Rad ChemiDoc MP型凝膠成像分析儀均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，CKX53型倒置顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)Tima1蛋白陽(yáng)性率 將膀胱癌及正常膀胱組織標(biāo)本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后，用切片機(jī)切成厚度為4 μm的切片，經(jīng)二甲苯和酒精脫蠟水化后，加入pH=7.4、濃度為0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)，并以3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。以非免疫血清封閉后，加入Tima1抗體(1 ∶150稀釋)孵育，4℃過(guò)夜，再加入生物素標(biāo)記二抗，孵育20 min。加入鏈霉菌素抗生素(辣根酶標(biāo)記)溶液反應(yīng)10 min，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木精復(fù)染和常規(guī)脫水封片后，磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作為陰性對(duì)照。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野。觀察每個(gè)組織的細(xì)胞著色情況，每張切片均由兩名高年資病理科醫(yī)生進(jìn)行觀察。Tima1蛋白主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，棕褐色顆粒為強(qiáng)陽(yáng)性，棕黃色為陽(yáng)性，淡棕色顆粒為弱陽(yáng)性，無(wú)顯色為陰性。細(xì)胞出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性、陽(yáng)性、弱陽(yáng)性染色均判斷為表達(dá)陽(yáng)性，表達(dá)陽(yáng)性率=陽(yáng)性切片數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Tiam1 mRNA表達(dá) 采用總RNA提取試劑盒提取兩組標(biāo)本的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取10 μL cDNA加入PCR反應(yīng)試劑盒中，以25 μL總反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，按照35個(gè)循環(huán)(95℃ 30 s、56℃ 15 s、72℃ 30 s)的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，上濃度為1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以β-肌動(dòng)蛋白作內(nèi)參對(duì)照，2-△△CT法計(jì)算Tiam1 mRNA的相對(duì)表達(dá)情況。β-肌動(dòng)蛋白上游引物序列5′-CTGTGCCCATCTACGAGGGGTATG-3′，下游引物序列5′-CCTTAATGTCACGCACGATTTCCC-3′；Tiam1上游引物序列5′-GCCAAGAACAT-TTAACAAGCAACG-3′；下游引物序列5′-TCTGAGCATACAAGTCACCCAAGG-3′。

1.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)Tiam1 蛋白表達(dá) 參照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取兩組標(biāo)本總蛋白，加入等量的上樣緩沖液，置于沸水浴中變性3～5 min，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，以美國(guó)伯樂(lè)Mini-Protean Ⅱ蛋白電泳槽將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上后，浸入1×TBST(含5%脫脂奶粉)中平衡2 h。加入一抗Tiam1和β-肌動(dòng)蛋白抗體(1 ∶800稀釋，4℃，孵育過(guò)夜)和辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(1 ∶2 000稀釋，37 ℃，孵育2 h)，以化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描檢測(cè)。結(jié)果用Tiam1灰度值比β-肌動(dòng)蛋白灰度值的相對(duì)值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分?jǐn)?shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，影響因素分析采用Cox回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 膀胱癌與正常膀胱組織Tiam1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 Tiam1在正常膀胱黏膜上皮細(xì)胞及膀胱癌細(xì)胞中均表達(dá)，主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，染色呈黃色至棕褐色不等(圖1)。正常膀胱黏膜上皮細(xì)胞Tiam1表達(dá)陽(yáng)性率為14.00%(7/50)，低于膀胱癌細(xì)胞的58.79%(137/233)(χ2=11.037，P<0.001)。

正常膀胱 低級(jí)別非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌 高級(jí)別非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌 高級(jí)別肌層浸潤(rùn)性膀胱癌

圖1 Tiam1在膀胱癌中的表達(dá)(×400)

2.2 膀胱癌Tiam1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組與Tiam1蛋白陰性表達(dá)組的臨床病理特征 膀胱癌Tiam1陽(yáng)性表達(dá)組和Tiam1陰性表達(dá)組的病理分級(jí)、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及復(fù)發(fā)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 Tiam1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組和Tiam1蛋白陰性表達(dá)組膀胱癌患者的臨床病理特征

注：*行根治性手術(shù)77例患者不予統(tǒng)計(jì)復(fù)發(fā)情況。

2.3 Cox多因素回歸分析 以是否復(fù)發(fā)(否=0，是=1)為因變量，性別(男=0，女性=1)、年齡(≤50歲=0，>50歲=1)、病理分級(jí)(低級(jí)別=0，高級(jí)別=1)、病理分期(Ta～T1=0，T2～T3=1)、腫瘤數(shù)目(單發(fā)=0，多發(fā)=1)、腫瘤直徑(≤2 cm=0，>2 cm=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(否=0，是=1)、Tiam1蛋白表達(dá)情況(陰性=0，陽(yáng)性=1)為協(xié)變量進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果顯示，病理高分級(jí)、病理分期為T2～T3、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性及Tiam1蛋白表達(dá)陽(yáng)性是膀胱癌患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 膀胱癌復(fù)發(fā)的多因素分析

2.4 膀胱癌與正常膀胱組織Tiam1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 正常膀胱細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞中Tiam1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.603±0.571)、(3.324±0.679)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.602，P<0.001)。低級(jí)別非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌、高級(jí)別非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌、高級(jí)別肌層浸潤(rùn)性膀胱癌Tiam1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(3.007±0.611)、(3.933±1.003)、(5.377±1.085)，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.033，P<0.001)，見(jiàn)圖2。

圖2 正常膀胱組織與膀胱癌組織中的Tiam1 mRNA表達(dá)

注：M為Marker，N為正常膀胱組織，1為低級(jí)別非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，2為高級(jí)別非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，3為高級(jí)別肌層浸潤(rùn)性膀胱癌。

2.5 膀胱癌與正常膀胱組織Tiam1蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較 正常膀胱組織與膀胱癌組織中Tiam1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.654±0.610)、(3.473±0.751)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.011，P<0.05)。低級(jí)別尿路上皮癌、高級(jí)別非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌及高級(jí)別肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中Tiam1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為(2.985±0.455)、(3.002±1.033)、(5.150±1.441)，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.370，P<0.001)，見(jiàn)圖3。

圖3 Tiam1蛋白在正常膀胱組織及膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)

注：N為正常膀胱，1為低級(jí)別尿路上皮癌，2為高級(jí)別非肌層浸潤(rùn)性尿路上皮癌，3為高級(jí)別肌層浸潤(rùn)性尿路上皮癌。

3 討 論

90%以上的原發(fā)性膀胱癌經(jīng)手術(shù)治療后均取得較好效果，但膀胱癌術(shù)后5年復(fù)發(fā)率為60%左右，且30%左右的患者會(huì)進(jìn)展為浸潤(rùn)性膀胱癌，而目前對(duì)于浸潤(rùn)性和復(fù)發(fā)性膀胱癌的治療效果有限，預(yù)后較差[9-10]。腫瘤轉(zhuǎn)移與患者預(yù)后密切相關(guān)，而目前膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制尚未完全闡明，因此，本研究探討Tiam1在膀胱癌組織中的表達(dá)情況，擬為膀胱癌的治療提供新靶點(diǎn)。

Tiam1屬于鳥苷酸交換因子家族成員之一，是一種具有高度親水性的胞液蛋白質(zhì)，其功能區(qū)域從N端至C端依次為Myr位點(diǎn)、PEST序列、PHn-CC-Ex、RBD、DHR、DH以及PHc結(jié)構(gòu)域[11]。Tiam1可通過(guò)與脂類或蛋白質(zhì)分子結(jié)合進(jìn)行亞細(xì)胞定位及活性調(diào)節(jié)，可催化Rho類蛋白的二磷酸鳥苷-三磷酸鳥苷交換反應(yīng)，參與調(diào)節(jié)Rho類蛋白活性，傳導(dǎo)不同細(xì)胞內(nèi)信號(hào)激活Rho三磷酸鳥苷酶，從而在多種生物分化過(guò)程中起作用[12]。Tiam1可特異性激活Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)，通過(guò)Tiam1-Rac1信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[13-14]。研究表明，Tiam1通過(guò)激活骨橋蛋白-CD44-Tiam1-Rac1通路抑制腫瘤抑制基因Rho二磷酸鳥苷離解抑制因子2，從而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散[15]。

本研究采用免疫組化方法檢測(cè)Tiam1蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，正常膀胱及膀胱癌組織中均有Tiam1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，但膀胱癌組織中的Tiam1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于正常膀胱組織(P<0.05)，且低分期、低分級(jí)、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未復(fù)發(fā)的膀胱癌患者的膀胱癌組織中Tiam1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于高分期、高級(jí)別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性及復(fù)發(fā)的膀胱癌患者(均P<0.05)，蛋白免疫印跡及實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果也證實(shí)，Tiam1蛋白在膀胱癌中的表達(dá)高于正常膀胱組織，說(shuō)明Tiam1作為促癌基因，在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤病理高分級(jí)、高分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性及Tiam1蛋白表達(dá)陽(yáng)性是膀胱癌患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，提示Tiam1蛋白可以作為膀胱癌復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)因子，應(yīng)對(duì)Tiam1陽(yáng)性表達(dá)的膀胱癌患者進(jìn)行密切的觀察隨訪，以早期診斷及治療。

綜上所述，Tiam1在膀胱癌中表達(dá)升高，且Tiam1蛋白表達(dá)陽(yáng)性與膀胱癌復(fù)發(fā)密切相關(guān)，是膀胱癌進(jìn)展、復(fù)發(fā)的重要細(xì)胞因子，但其促進(jìn)膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。