管博文，盧延華，蘇路路，王玉全，李德冠，孟愛民*

(1.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心，北京 100021； 2.中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所，天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室，天津 300192)

據(jù)聯(lián)合國經(jīng)濟和社會事務部人口司調(diào)查統(tǒng)計，隨著醫(yī)療水平的提高，預計2050年全球總人口達到98億，其中老齡人口約占31億。中國人口老齡化進程與全球人口老齡化趨勢一致，老齡化已經(jīng)成為社會發(fā)展中不可忽視的影響因素。1969年，病理學家Wolford在文章中提出免疫衰老，免疫系統(tǒng)參與正常脊柱動物的老化，并調(diào)節(jié)老化過程[1-3]。因此免疫衰老是機體衰老的重要組成部分，免疫系統(tǒng)的衰老會導致老年個體更易感染、罹患腫瘤以及對疫苗的應答下降[4]。本文就從免疫器官和外周血免疫分型等方面比較老年小鼠與年輕小鼠存在的差異，旨在為免疫衰老相關研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

老年小鼠：8只19月齡的SPF級C57BL/6J雄性小鼠，體重28～38 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]，年輕小鼠：8只8周齡的SPF級C57BL/6J雄性小鼠，體重19～22 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]。老年與年輕小鼠均飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所動物房屏障環(huán)境[SYXK(京)2015-0035]，溫度為20℃～26℃，相對濕度為40%～70%，壓差大于10 Pa，照明強度為15～20 lx，每12 h晝夜交替一次。本實驗經(jīng)過中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所IACUC的批準，批準號為MAM17002。并根據(jù)3R原則對實驗動物的使用和飼養(yǎng)給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

熒光標記抗體NK1.1-FITC購于Biolegend；CD11b-APC購于Invitrogen；B220-percp、F4/80-PE、CD4-PE-cy7、CD8a-APC-cy7等購于BD公司；EDTA-K3購于Sigma公司；紅細胞裂解液購于Invitrogen公司。外周血計數(shù)及分類由全自動血液分析儀PentraDX120(ABX)分析；血細胞免疫分型應用BD流式分析儀(BD FACSAria II cell sorter)。

1.3 實驗方法

1.3.1 外周血細胞計數(shù)及分類

將小鼠稱重，0.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(50 mg/kg)。進行內(nèi)眥靜脈取血，EDTA-K3 抗凝，血細胞計數(shù)儀測定白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)、血小板、血紅蛋白含量、中性粒細胞和淋巴細胞百分比[5]。取血后脫頸安樂死。

1.3.2 免疫臟器指數(shù)

小鼠安樂死后，取胸腺和脾分別稱重，計算胸腺系數(shù)和脾系數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/小鼠體重(g)，脾指數(shù)=脾重量(mg)/小鼠體重(g)[6-7]。

1.3.3 外周血免疫分型檢測

每個血樣取50 μL，加入1 mL 1×紅細胞裂解液，室溫條件下裂解8 min(期間混勻兩次)，1500 r/min離心5 min，4℃。棄上清，保持每個樣本100 μL體系，加入外周血混合抗體4.5 μL，冰上避光孵育30 min。2 mL PBS洗一遍，離心條件不變。加入300 μL PBS過濾到流式管中，上機檢測[8]。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 外周血計數(shù)及分類

外周血分析結果如表1所示，老年小鼠RBC和PLT相對于年輕小鼠有明顯增高，具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，其中血小板升高接近30%。相對于年輕小鼠，老年小鼠的NE%升高了14.5%，LY%下降了15.63%，均具有極顯著差異(P<0.001)。WBC和HGB沒有顯著性變化。提示老年小鼠出現(xiàn)血小板升高，白細胞分化偏移。

2.2 免疫臟器指數(shù)

與年輕小鼠相比，老年小鼠胸腺重量降低，脾重量增加。胸腺指數(shù)降低，與年輕小鼠差異有顯著性(P<0.001)，脾指數(shù)差異無顯著性(見圖1)。

2.3 外周血免疫分型

流式分析外周血免疫細胞分型測定如圖2所示。主要檢測輔助T細胞(CD4)、細胞毒T細胞(CD8a)、B淋巴細胞(B220)、自然殺傷細胞(NK1.1)，單核細胞采用F4/80和CD11b共標。其中輔助T細胞、細胞毒T細胞和漿細胞是從單個核細胞亞群去分析，NK細胞和單核細胞是從白細胞群去分析(圖2)。結果顯示相對于年輕小鼠，老年組CD4細胞百分比明顯降低[分別為(20.14 ± 3.89)%，(10.80 ± 3.04)%]，差異具有極顯著性(P<0.001)，見圖3A。其他類型的免疫細胞未見明顯差異，見圖3B～3E。

3 討論

本文檢測老年和年輕小鼠外周血計數(shù)及免疫細胞分型，結果顯示老年小鼠外周血血小板有明顯的升高，中性粒細胞和淋巴細胞的比例出現(xiàn)了偏移。老年小鼠胸腺指數(shù)下降。外周血免疫細胞分型中CD4細胞比例明顯降低。

實驗結果顯示，從臟器總體來看相對于年輕小鼠，老年小鼠有很多器官衰老，在免疫方面產(chǎn)生缺陷，出現(xiàn)胸腺萎縮，CD4/CD8比值下降等現(xiàn)象。與人進入老年以后狀態(tài)相似，免疫力下降，易患各種疾病。從器官水平看，老年小鼠的胸腺指數(shù)比年輕小鼠的胸腺指數(shù)有明顯下降，呈現(xiàn)顯著性差異。理論上隨著年齡的增大，記憶T細胞池在增加，但是體內(nèi)的T細胞總量會被維持在一定量，并且胸腺的衰老萎縮也導致幼稚T細胞數(shù)量的減少。老年人和老齡化小鼠的免疫系統(tǒng)減弱的變化趨勢是一致的[9]。

臨床上老年人的造血系統(tǒng)出現(xiàn)髓系細胞比例升高、淋系細胞比例降低的分化偏移的現(xiàn)象，與老年人免疫力降低、髓系腫瘤高發(fā)有關[10]。本次檢測發(fā)現(xiàn)老年小鼠外周血的NE%升高，LY%下降，與人類老齡化改變類似。林帥等研究也顯示類似的結果，相比于成年小鼠，12月齡的老年小鼠NE%升高，LY%下降[8]。出現(xiàn)髓系分化偏移的現(xiàn)象，本質(zhì)上是造血干細胞的衰老導致細胞周期失調(diào)，并且不受控制的向髓系細胞分化。造血干細胞衰老則是細胞從靜止穩(wěn)態(tài)進入不受調(diào)控的分裂分化狀態(tài)，使NE%升高，LY%下降，破壞血液中免疫細胞比例的平衡，降低免疫力[11]。

表1 老年小鼠與年輕小鼠外周血計數(shù)比較(n=8)

注：與年輕小鼠相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

Note. Compared with the young mice，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.

注：A：胸腺指數(shù)；B：脾指數(shù)。與年輕小鼠相比，***P<0.001。圖1 老年小鼠與年輕小鼠臟器指數(shù)比較Note. A, Thymus index. B, Spleen index. Compared with young mice，***P<0.001.Figure 1 Comparison of organ indexes between the aged and young mice

圖2 流式細胞儀分析時門的設置及典型圖Figure 2 Representative gating strategy for peripheral blood immune cell phenotypes analyzed by flow cytometry

注：A：CD4+；B：CD8+；C：B220+；D：NK1.1+；E：CD11b+F4/80+。與年輕小鼠相比，***P<0.001。圖3 老年小鼠與年輕小鼠外周血免疫細胞分型比較Note. A, CD4+. B, CD8+. C, B220+. D, NK1.1+. E, CD11b+F4/80+. Compared with the young mice，***P<0.001.Figure 3 Comparison of peripheral blood immune cell typing between the aged and young mice

相較于年輕人，健康男性老年人紅細胞、血紅蛋白和血小板傾向于降低，出現(xiàn)老年人貧血現(xiàn)象[10, 12-13]。C57小鼠外周血血小板計數(shù)比人類的要高，本次檢測老年鼠血小板有升高趨勢，與健康老年人的變化趨勢有一定的差異。提示老年小鼠在血小板數(shù)量和功能的代償方面可能與老年人有一定的差異。Simon等人的研究也顯示，血小板會在炎癥感染和大量出血等應激情況下，直接從造血干細胞分化成血小板，提示老年小鼠可能處于慢性炎癥狀態(tài)，炎癥狀態(tài)促使造血干細胞不斷的向巨核細胞分化，最終導致血小板的升高[14]。外周血細胞檢測中出現(xiàn)血小板有明顯上升，三系血細胞同時增多，暗示老年小鼠可能患有老年真性紅細胞增多癥(polycythemia vera，PV)[15-16]，有潛在成為PV動物模型的可能。但是這點與人外周血計數(shù)規(guī)律并不一致，相較于年輕人，健康男性老年人紅細胞、血紅蛋白和血小板傾向于降低[10, 12-13]。

外周血免疫細胞分型檢測顯示CD4淋巴細胞的比例下降，CD8不變，導致CD4/CD8比例下降。林帥等文獻中除CD4有顯著下降外，NK1.1和CD11b有明顯的上升并有顯著性差異[8]。CD4/CD8比例下降暗示老年小鼠免疫系統(tǒng)功能下降，與臨床上老年人CD4細胞的減少，免疫力低下相似。小鼠月齡的增加導致胸腺的萎縮，是免疫衰老的直接原因[18]，CD4細胞的減少CD4+/CD8+比值的下降與老年人細胞亞群失調(diào)的情況一致[2]。

隨著年齡增長，免疫系統(tǒng)出現(xiàn)衰老性改變。這些改變過程非常復雜，主要包括以下幾個方面：(1)免疫細胞；(2)淋巴器官和非淋巴組織中的微環(huán)境(免疫細胞駐留的組織)；(3)與免疫細胞及其微環(huán)境相互作用的循環(huán)因子，包括趨化因子、細胞因子和其他可溶性分子[19-20]。從1969年免疫衰老概念的提出，免疫衰老研究取得了很大的進展，不僅觀察到不同免疫細胞數(shù)量和比例的改變，還注意探討不同亞型免疫細胞功能變化以及免疫細胞與微環(huán)境及系統(tǒng)環(huán)境相互作用方式的變化[21]。這些改變作為免疫衰老，甚至作為全身衰老生物學標記方面也取得了進展[22]。這些深入研究對闡明衰老機制、探討干預老年人免疫功能衰老的靶點和策略、改善老年人生活質(zhì)量具有重要意義[23]。

本文對老年小鼠外周血和免疫器官指數(shù)進行了測定并與人類老齡化改變進行了初步比較分析。作為研究衰老及老齡化疾病的重要模型小鼠，研究結果將為免疫衰老相關研究提供基礎數(shù)據(jù)。