高脂血癥食蟹猴模型的建立及初步分析

唐明甜，肖百全，徐世千，李比海，劉忠華，饒軍華*

(1.廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510260； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510642)

近年來(lái)，隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加快以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，血脂異常總體患病率呈快速上升趨勢(shì)，主要表現(xiàn)為高血脂。高血脂是冠心病、心肌梗死、心臟性猝死的重要危險(xiǎn)因素[1]。目前，高脂血癥及其并發(fā)癥幾乎占了全球死亡率的50%[2]，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1000億美元。其發(fā)病率高、分布廣，且呈年輕化趨勢(shì)[3-4]。因此，高脂血癥動(dòng)物模型對(duì)于脂代謝性疾病以及由高血脂癥繼發(fā)的心腦血管疾病的研究具有重大意義[5]。目前，已報(bào)道的用于高脂血癥動(dòng)物模型研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要有兔、大鼠、小鼠等[5-7]，模型相對(duì)成熟。然而，近年來(lái)全球范圍內(nèi)生物制品類藥物研發(fā)非常迅速，已經(jīng)成為生物醫(yī)藥主要的增長(zhǎng)點(diǎn)。生物制品類藥物有其自身特點(diǎn)，其中種屬特異性是該類藥物研發(fā)時(shí)需要著重考量的因素，例如2017年美國(guó)FDA批準(zhǔn)的首個(gè)生物制品類降脂藥Praluent(PCSK9抑制劑[8])在臨床前毒理學(xué)研究中大量使用靈長(zhǎng)類動(dòng)物，其主要原因?yàn)樵擃愃幬锖挽`長(zhǎng)類動(dòng)物之間存在交叉反應(yīng)，而與嚙齒類動(dòng)物不存在交叉反應(yīng)，即Praluent給藥后可在靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生藥理學(xué)和/或毒理學(xué)效應(yīng)，而不會(huì)與嚙齒類動(dòng)物的組織產(chǎn)生反應(yīng)，喪失其藥理學(xué)和毒理學(xué)的作用基礎(chǔ)。目前，采用半流質(zhì)膳食乳劑模擬人類高脂血癥發(fā)病進(jìn)程的靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型尚未見(jiàn)報(bào)道[9-13]。

相比較于其他常用高脂血癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(NHP)具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)NHP在基因、生理、生化指標(biāo)和解剖學(xué)等方面都比其他動(dòng)物更接近人類；(2)發(fā)病機(jī)制及伴隨的風(fēng)險(xiǎn)因子也與人類疾病高度相似；(3)NHP有較長(zhǎng)的生命周期；(4)能為藥物的發(fā)現(xiàn)提供十分重要的臨床前信息，特別是對(duì)于生物制品類藥物，靈長(zhǎng)類動(dòng)物具有明顯種屬的優(yōu)勢(shì)；(5)從NHP實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)確保了將來(lái)臨床應(yīng)用的更高的效率和可靠性，使NHP成為臨床前研究的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。

在此背景下，本研究選用食蟹猴為研究對(duì)象，模擬人類過(guò)度攝入高糖高脂飲食，采用灌胃法給予半流質(zhì)高糖高脂膳食乳劑誘導(dǎo)建立高脂血癥食蟹猴模型，旨在豐富現(xiàn)有高脂血癥靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型庫(kù)，為生物制品類降脂藥的研發(fā)提供合適、理想的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)雄性食蟹猴22只，來(lái)源于廣東藍(lán)島生物技術(shù)有限公司[SCXK(粵)2014-0010]，成年組10只(對(duì)照組5只，處理組5只)，體重4～6 kg，5～7歲；中老年組12只(對(duì)照組6只，處理組6只)，體重7～10 kg，10～12歲。動(dòng)物均飼養(yǎng)于廣東省生物資源應(yīng)用研究所靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心普通級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(12 h/12 h晝夜周期，濕度40%～70%，溫度16℃～26℃)[SYXK(粵)2018-0187]。本研究所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣東省藍(lán)島生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)(LD20150518)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

膽固醇(廣州威佳科技有限公司)；膽酸鹽(廣州威佳科技有限公司)；蔗糖(廣州華僑食品專營(yíng)店)；豬油(廣州市肉聯(lián)廠)；舒泰50(Zoletil 50)麻醉劑。SANLI一次性使用人體靜脈血樣采集容器；離心管(Eppendorf管)1500 μL/2000 μL；離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5810R)；全自動(dòng)生化析儀(Hitachi 7020、7180)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 膳食給喂方法

對(duì)照組雄性食蟹猴每日正常飼養(yǎng)，處理組雄性食蟹猴每日與對(duì)照組雄性食蟹猴一致，給予常規(guī)猴維持飼料。同時(shí)，根據(jù)雄性食蟹猴體重每日通過(guò)鼻飼管灌喂一次半流質(zhì)高糖高脂膳食乳劑(膳食乳劑均為每日現(xiàn)配)，每只每天的灌胃劑量為5 mL/kg，每周6 d，連續(xù)灌喂21個(gè)月，每日記錄雄性食蟹猴臨床癥狀(例如活動(dòng)、精神、糞便狀況等)。誘導(dǎo)過(guò)程中半流質(zhì)高糖高脂膳食乳劑給予量每?jī)蓚€(gè)月隨雄性食蟹猴體重增減進(jìn)行調(diào)整。

半流質(zhì)高糖高脂膳食乳劑質(zhì)量比配方為：蔗糖∶豬油∶膽固醇∶膽酸鹽=10∶10∶1∶0.5，將各組份按其含量混合均勻，加熱至約50℃，攪拌均勻乳化即得膳食乳劑。

1.3.2 體重、BMI動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

每2個(gè)月監(jiān)測(cè)一次雄性食蟹猴的體重并計(jì)算BMI，計(jì)算方法：BMI=體重(kg)/身高(m2)，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的身高為坐高[14]。

1.3.3 血脂四項(xiàng)的測(cè)定

采血前禁食約12～14 h后，后肢靜脈采血2 mL，離心10 min(4℃，3000 r/min)，分離血清，于-80℃凍存?zhèn)溆?。TC、TG采用氧化酶法測(cè)定， HDL-C、LDL-C采用直接法，用日立(Hitachi 7020、7180)全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 雄性食蟹猴體重、BMI結(jié)果

與成年對(duì)照組相比，在造模期間，成年處理組雄性食蟹猴體重和BMI每個(gè)月均上升，但未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)。與中老年對(duì)照組相比，中老年處理組雄性食蟹猴在造模第5月體重上升，但改變不明顯(P>0.05)。在造模期間體重和BMI均未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)。如圖1、圖2所示。

成年雄性食蟹猴中，造模后因機(jī)體抵抗力較強(qiáng)，且因年齡較小，體重未達(dá)到穩(wěn)定，所以呈緩慢、均勻上升趨勢(shì)；中老年處理組雄性食蟹猴，在造模前后體重和BMI出現(xiàn)短暫的升高或基本持平，但在造模的中后期，由于灌喂了較長(zhǎng)時(shí)間，可能引起機(jī)體的脂代謝紊亂，從而表現(xiàn)為體重和BMI的下降。

注：A：成年食蟹猴；B：中老年食蟹猴。圖1 雄性食蟹猴體重變化Note. A, Adult cynomolgus monkeys. B, Middle-aged and old cynomolgus monkeys.Figure 1 Changes in body weight of the male cynomolgus monkeys

注：A：成年食蟹猴；B：中老年食蟹猴。圖2 雄性食蟹猴BMI變化Note. A, Adult cynomolgus monkeys. B, Middle-aged and old cynomolgus monkeys.Figure 2 Changes in BMI of the male cynomolgus monkeys

2.2 造模前后雄性食蟹猴血脂對(duì)比結(jié)果

2.2.1 甘油三酯(TG)結(jié)果

與成年對(duì)照組相比，成年處理組1～21月血清TG水平均未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)；與中老年對(duì)照組相比，中老年處理組1～21月TG水平均未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)，變化如圖3所示。

圖3 雄性食蟹猴血清TG變化曲線圖Figure 3 Curve graph of serum TG in the male cynomolgus monkeys

2.2.2 膽固醇(TC)結(jié)果

與成年對(duì)照組相比，成年處理組2～21月血清TC水平明顯升高(0.010.05)；中老年處理組第2～21月TC水平均明顯升高(0.01

注：與成年食蟹猴對(duì)照組相比，*0.01

2.2.3 高密度脂蛋白(HDL-C)結(jié)果

與成年對(duì)照組相比，成年處理組在處理第3、5、9月時(shí)HDL-C水平明顯升高(0.010.05)；中老年處理組除第7月HDL-C明顯升高外(P<0.01)，造模其它時(shí)間HDL-C水平均未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)，變化如圖5所示。

注：與成年食蟹猴對(duì)照組相比，*0.01

2.2.4 低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)結(jié)果

與成年對(duì)照組相比，成年處理組除第1個(gè)月LDL-C水平未見(jiàn)明顯改變，其它處理時(shí)間LDL-C均明顯升高(0.010.05)，變化如圖6所示。

注：與成年食蟹猴對(duì)照組相比，*0.01

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外在進(jìn)行制作高脂血癥動(dòng)物模型時(shí)所采用的方法多為飼喂高脂飼料，將高能量物質(zhì)摻入動(dòng)物飼料之中，由動(dòng)物自由采食，但高脂飼料有其自身物理特點(diǎn)：油膩且適口性差，嚙齒類動(dòng)物食用高脂飼料尚可進(jìn)行，但也會(huì)由于飼料硬度不足導(dǎo)致動(dòng)物不喜食，且高脂飼料在長(zhǎng)期試驗(yàn)中保存條件高，否則容易發(fā)霉變質(zhì)。眾所周知，靈長(zhǎng)類動(dòng)物具有較高的智商，在進(jìn)食時(shí)喜愛(ài)用飼料玩耍。在正常飼養(yǎng)過(guò)程中，多數(shù)飼料被其玩耍丟棄而浪費(fèi)，該特點(diǎn)決定了很難精確計(jì)算每只動(dòng)物每天攝入的飼料量。初步分析這也是眾多文獻(xiàn)中報(bào)道的以高脂飼料飼養(yǎng)方式復(fù)制高血糖、高血脂模型時(shí)間特別長(zhǎng)的原因，因?yàn)閯?dòng)物每天實(shí)際上攝入的有效熱量有限，多數(shù)飼料被動(dòng)物玩耍丟棄。為解決靈長(zhǎng)類動(dòng)物不能精確計(jì)算熱量攝入量的問(wèn)題，本研究首先將高糖、高脂等高能量的物質(zhì)從飼料中分離，并通過(guò)一定的方式制備為半流質(zhì)高糖高脂膳食乳劑，然后采用鼻飼灌喂的方式按照動(dòng)物體重定量給予。該法的優(yōu)勢(shì)：(1)改善高脂飼料適口性差而導(dǎo)致動(dòng)物不喜食、易變質(zhì)、無(wú)法精確定量的不足；(2)可對(duì)動(dòng)物攝入的能量(糖脂)量化，縮短模型的制作周期。

近年來(lái)，高脂血癥的發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)[3-4]，為對(duì)比成年人群和中老年人群在攝入高能量物質(zhì)后血脂升高的差異，本文中除選用了中老年雄性食蟹猴(>10歲)為研究對(duì)象，還增加了成年雄性食蟹猴(5～7歲)進(jìn)行比較，中老年和成年雄性食蟹猴都分為對(duì)照組和處理組，分組后按照體重給予半流質(zhì)高糖高脂膳食乳劑。

TG結(jié)果表明，成年和中老年處理組雄性食蟹猴造模1～21月TG平均水平與相應(yīng)的對(duì)照組相比均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，該結(jié)果提示，本研究中的半流質(zhì)高糖高脂膳食乳劑配方對(duì)成年和中老年雄性食蟹猴血清TG的影響較小，連續(xù)處理21月尚未能引起雄性食蟹猴TG升高，推測(cè)該配方可能不適合用于復(fù)制高TG模型。

TC結(jié)果表明，成年和中老年處理組雄性食蟹猴在造模第3個(gè)月血清TC均明顯升高，造模7個(gè)月后基本所有處理組雄性食蟹猴TC水平均大于6.2 mmol/L，高TC一直持續(xù)至造模第21月。LDL-C結(jié)果表明，成年處理組除第1個(gè)月LDL-C水平未見(jiàn)明顯改變，其它時(shí)間LDL-C均明顯升高。與中老年對(duì)照組相比，中老年處理組在第3、7、11、17、19、21個(gè)月LDL-C水平明顯升高，其它時(shí)間LDL-C水平均未見(jiàn)明顯改變。其可能的機(jī)制為高脂和高TC的攝入使動(dòng)物體內(nèi)血液的TC含量劇增，TC代謝障礙，從而引起機(jī)體的血脂代謝紊亂，直接導(dǎo)致LDL-C的代謝障礙并在體內(nèi)蓄積[15]，從而表現(xiàn)為高TC血癥和高LDL-C血癥。

HDL-C結(jié)果表明，造模后各造模組HDL-C平均水平均出現(xiàn)短暫的升高，但升高的幅度較低，高HDL-C水平持續(xù)的時(shí)間也較短，分析HDL-C出現(xiàn)波動(dòng)的原因可能與給予半流質(zhì)高糖高脂膳食乳劑有關(guān)，因?yàn)楸灸Ｐ蜑橥庠葱蕴?、脂攝入性增加模型，在大量攝入膽固醇后，代償性的促進(jìn)膽固醇的排泄而引起HDL-C短暫的升高，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，基本適應(yīng)了灌服膽固醇等操作，HDL-C逐漸恢復(fù)至正常水平。

本文結(jié)果表明，經(jīng)半流質(zhì)高糖高脂膳食乳劑造模后，雄性食蟹猴血漿TC和LDL-C水平明顯升高。由于目前尚無(wú)食蟹猴高血脂判斷的標(biāo)準(zhǔn)，我們參考美國(guó)膽固醇教育計(jì)劃成人治療組第三次指南[16](ATPⅢ)中人類膽固醇水平和本機(jī)構(gòu)食蟹猴背景數(shù)據(jù)研究結(jié)果，可認(rèn)為食蟹猴在TC大于6.20 mmol/L時(shí)即可診斷為高TC血癥；在LDL-C大于3.64 mmol/L時(shí)即可診斷為高LDL-C血癥。根據(jù)這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)中成年處理組于造模第3月時(shí)5只雄性食蟹猴全部造模成功；中老年處理組至造模第3月時(shí)6只雄性食蟹猴全部造模成功，至第21月時(shí)所有處理組雄性食蟹猴的血脂依然處于高水平，所有造模成功雄性食蟹猴均為高脂蛋白血癥Ⅱa表型。

根據(jù)高脂血癥在臨床上的分類[17-18]，用半流質(zhì)高糖高脂膳食乳劑誘導(dǎo)建立的食蟹猴模型具有高TC血癥和高LDL-C血癥的特征，屬于高TC血癥、高LDL-C血癥[19-20]，且該造模方法對(duì)成年雄性食蟹猴和中老年雄性食蟹猴均敏感。通過(guò)各項(xiàng)血脂指標(biāo)分析，本研究已經(jīng)建立了高脂血癥食蟹猴模型，可為人類高脂血癥發(fā)病機(jī)制及藥物臨床前藥效評(píng)估研究提供理想的動(dòng)物模型。