李燕 吝佩 綦曉龍

摘 要 目的：建立HPLC法同時(shí)測定麒麟丸（制何首烏、墨旱蓮、淫羊藿等）中3種成分的含量。方法：麒麟丸50%乙醇提取液的分析采用Vensuil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 mm）；以含0.05%三氟乙酸的水溶液（A）和含0.05%三氟乙酸的乙腈溶液（B）為流動相，梯度洗脫；體積流量1.2 ml/min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm。結(jié)果：橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷分別在6～18 mg/ml（r=0.999 8），3～9 mg/ml（r=0.999 8），2～6 mg/ml（r=0.999 9）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為95.9%、93.6%、92.4%，RSD分別為1.6%、3.0%、4.6%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 麒麟丸 橙皮苷 丹酚酸B 淫羊藿苷 HPLC

中圖分類號：O657.72； R286 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）13-0061-04

Simultaneous determination of three constituents in Qilin pills by HPLC*

LI Yan1**， LIN Pei2， QI Xiaolong2（1. Shanghai Jinpibao Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200080， China； 2. Shanghai AppTec R&D Co.， Ltd.， Shanghai 200131， China）

ABSTRACT Objective： To establish an HPLC method for the simultaneous determination of the contents of three constituents in Qilin pills （ Polygoni Multiflori Radix Praeparata， Ecliptae Herba， Epimedii Folium）. Methods： The analysis of 50% ethanol extract of Qilin pills was performed on a Vensuil XBP C18 （ 4.6 mm×250 mm， 5 mm） by gradient elution with the mobile phase comprising of acetonitrile-0.05% trifluoroacetic acid at volume flow 1.2 ml/min， 30 ℃ and detection wavelength 220 nm. Results： Hesperidin， salvianolic acid B and icariin showed good linear relationship in the ranges of 6-18 mg/ml （r=0.999 8），3-9 mg/ml （r=0.999 8），2-6 mg/ml （r=0.999 9） with average recoveries of 95.9%， 93.6% and 92.4% and RSDs of 1.6%， 3.0% and 4.6%， respectively. Conclusion： This method is accurate and reproducible and can be used for the quality control of Qilin pills.

KEy WORDS Qilin pills， hesperidin； salvianolic acid B； icariin； HPLC

麒麟丸由制何首烏、墨旱蓮、淫羊藿、菟絲子、鎖陽、黨參、郁金、枸杞子、覆盆子、山藥、丹參、黃芪、白芍、青皮、桑椹等15味中藥組成，能夠補(bǔ)腎填精，益氣養(yǎng)血。適用于腎虛精虧，血?dú)獠蛔?，腰膝酸軟，倦怠乏力，面色不華，男子精液清稀，陽痿早泄，女子月經(jīng)不調(diào)，或男子不育癥，女子不孕癥見有上述證候者[1]。目前，該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)立了制何首烏中大黃素含量的薄層色譜掃描法作為含量測定項(xiàng)，文獻(xiàn)中也僅有報(bào)道制何首烏中二苯乙烯苷的含量測定方法[2-4]，對該組方中其它成分的含量測定方法未見報(bào)道。該方中青皮具有疏肝理氣、消積化滯的功效，其主要活性成分為黃酮類成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明橙皮苷具有抗氧化和延緩衰老的作用[5-6]；丹參具有活血化瘀，通經(jīng)止痛的功效，用于胸痹心痛，癥瘕積聚，月經(jīng)不調(diào)等。其主要活性成分為丹參酮和丹酚酸類組分。其中丹酚酸B具有抗氧化、防治動脈粥樣硬化等作用[7-8]；淫羊藿具有補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨的功效，用于腎陽虛衰，陽痿遺精，筋骨痿軟；淫羊藿總黃酮為其主要活性成分，其中淫羊藿苷具有增強(qiáng)免疫力，抗氧化和抗衰老的藥理作用[9-11]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷為指標(biāo)成分，建立HPLC方法同時(shí)測定上述3種成分的含量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；HZQ-50H加熱回旋振蕩器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；5810R離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

橙皮苷購自百靈威科技（批號L190Q57，純度98.1%）；丹酚酸B購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司（批號PRF7060803，純度98.3%）；淫羊藿苷購自南京景竹生物科技有限公司（批號JZ16121109，純度98.7%）；麒麟丸來自廣東太安堂藥業(yè)股份有限公司（批號A20161101、B20180807和B20180809，60 g/瓶）；乙腈、三氟乙酸為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純凈水。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液制備

取麒麟丸適量研細(xì)，精密稱取2 g，至100 ml具塞錐形瓶中，加入50%乙醇溶液50 ml，稱定重量，37 ℃振搖30 min，再超聲30 min，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過0.45 mm聚四氟乙烯濾膜，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2 對照品溶液制備

取橙皮苷對照品30 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，精密加入1 ml二甲基亞砜使溶解，然后加入50%乙醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，作為橙皮苷的對照品溶液；稱取16 mg丹酚酸B，置于100 ml量瓶中，加入50%乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻，作為丹酚酸B的對照品溶液；精密稱取10 mg淫羊藿苷，置于100 ml量瓶中，加入50%乙醇稀釋并定容至刻度，作為淫羊藿苷的對照品溶液；精密吸取上述各對照品溶液各5 ml置于100 ml量瓶中，加50%乙醇定容至刻度，搖勻，制成每1 ml含橙皮苷15 mg、丹酚酸B 8 mg、淫羊藿苷5 mg的混合對照品溶液；精密吸取2、3、4、5和6 ml至10 ml量瓶中，加50%乙醇定容至刻度，即得系列濃度的混合對照品溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Vensuil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 mm）；流動相A為含0.05%三氟乙酸的水溶液、B為含0.05%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脫（0～48 min，90%A→70%A；48～55 min，70%A→5%A）；體積流量1.2 ml/min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm；進(jìn)樣量10 ml。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性

將對照品和供試品溶液分別進(jìn)樣測試，理論塔板數(shù)均>5 000，各峰與相鄰峰的分離度>1.5（圖1）。

2.2 線性關(guān)系考察

以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、質(zhì)量濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（表1）。

2.3 精密度試驗(yàn)

同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測定，計(jì)算橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷色譜峰的峰面積，RSD分別為0.8%、1.5%和1.1%，表明儀器的精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一供試品（批號A20161101）粉末2.0 g，共6份，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，HPLC測定并計(jì)算得橙皮苷、丹酚酸B、淫羊藿苷的RSD分別為0.8%、1.5%、1.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液于0、20、50、90 h進(jìn)樣測定，測得橙皮苷、丹酚酸B、淫羊藿苷峰面積RSD分別為0.6%、1.2%、0.7%，說明供試品溶液在90 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取含有量已知的供試品（批號A20161101）粉末0.8 g、1.0 g、1.2 g各3份，精密加入相當(dāng)于含有量的混合對照品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行HPLC測定，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，高、中、低三種濃度的加樣回收率均在90%～108%之間，且RSD均小于5%，說明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.7 樣品的含量測定

取3批次的麒麟丸按供試品制備方法制備樣品，分別進(jìn)行HPLC測定，結(jié)果見表3和圖2。

結(jié)果顯示，三批樣品中橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷的色譜峰均能與其它色譜峰良好分離，且分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于5 000，說明該方法能夠用于不同批次的產(chǎn)品檢測。

3 討論

流動相曾選擇考察了乙腈-磷酸、乙腈-醋酸-醋酸銨、乙腈-三氟乙酸和不同梯度下的洗脫情況，發(fā)現(xiàn)在乙腈-0.05%三氟乙酸條件下洗脫色譜峰峰型和分離效果均比較好，因此選擇乙腈-0.05%三氟乙酸作為流動相。

采用二極管陣列檢測器，在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷的最大波長分別為282 nm、286 nm、270 nm，此外，3種成分在波長220 nm和230 nm均有明顯的吸收，因此，分別對220 nm、230 nm和270 nm波長下的色譜峰進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)220 nm波長下各成分的響應(yīng)值最大，且分離度良好，因此，選擇220 nm作為檢測波長。

由于投料所用藥材批次不同，2016年和2018年批次樣品中的橙皮苷和丹酚酸B含量略有差異。但多批次檢測結(jié)果表明該方法簡單適用，可同時(shí)檢測3個(gè)指標(biāo)性成分的含量，節(jié)約檢測時(shí)間和成本，為麒麟丸改進(jìn)質(zhì)量控制方法提供參考依據(jù)。

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