楊琳 李慧敏 朱艷

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是臨床上較為常見的妊娠期并發(fā)癥，流行病學(xué)研究顯示，ICP的發(fā)病率持續(xù)性維持在334～566/10萬人左右，在合并有膽道系統(tǒng)疾病的孕產(chǎn)婦中，ICP可呈現(xiàn)出明顯的高發(fā)態(tài)勢[1-2]。

ICP可以影響到胎盤的氧化應(yīng)激反應(yīng)、促進(jìn)高膽汁酸代謝，進(jìn)而導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)急性缺氧，但其發(fā)病機(jī)制仍然缺乏可靠的臨床研究。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)、缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)等細(xì)胞炎癥因子或者氧化應(yīng)激誘導(dǎo)因子，能夠在促進(jìn)高膽汁酸代謝情況下的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡、增加胎盤微血管的血栓形成，影響到胎盤局部血流灌注的穩(wěn)定性等，進(jìn)而促進(jìn)胎兒宮內(nèi)急慢性缺氧，導(dǎo)致胎兒及母體不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[3]。為了進(jìn)一步揭示ICP患者肝功能、胎盤組織中HSP70、HIF-1α的表達(dá)變化，本研究選取本院產(chǎn)科確診的ICP患者69例，探討相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)及其與患者病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，為臨床上ICP患者的臨床預(yù)后評估或者早期診斷提供參考。

資料與方法

1.一般資料：選取本院產(chǎn)科確診的ICP患者69例作為ICP組，收治時(shí)間2015年1月—2017年1月，選取同期正常妊娠婦女60例作為對照組。ICP組，年齡24～39歲，平均(29.8±3.2)歲；孕周34～39周，平均(36.7±1.8)周；孕次(2.2±0.7)次，產(chǎn)次(0.8±0.5)次，依據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》第八版中的ICP病情劃分標(biāo)準(zhǔn)[4]，分為輕度和重度，其中輕度ICP患者41例，重度ICP患者28例。對照組，年齡23～39歲，平均(29.5±4.7)歲；孕周36～41周，平均(38.8±1.5)周；孕次(2.0±0.8)次，產(chǎn)次(0.9±0.4)次。兩組的年齡、孕次、產(chǎn)次比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：納入標(biāo)準(zhǔn)包括(1)ICP的診斷標(biāo)準(zhǔn)、病情分度參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)[4]；(2)納入研究對象均接受剖宮產(chǎn)手術(shù)；(3)本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)及研究對象的知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)包括(1)合并其他病毒感染性疾??；(2)妊娠前伴有病毒性肝炎、肝腎功能疾??；(3)合并胎膜早破、妊娠糖尿病、妊娠高血壓、結(jié)締組織疾病等其他妊娠合并癥。

3.肝功能指標(biāo)檢測：檢測兩組妊娠婦女的血清甘膽酸(Glycocholic acid，GC)、總膽汁酸(Total bile acid，TBA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(Total bilirubin，TBIL)。采集患者肘部靜脈血3 ml，加入抗凝劑2 ml，1 000 r/min離心(離心半徑10 cm)5 min，采用生物酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測相關(guān)指標(biāo)，CG、TBA、ALT、AST、TBIL檢測試劑盒購自羅氏生物檢測應(yīng)用公司，配套試劑及儀器購自南京伯斯金生物科技有限公司。

4.胎盤組織HSP70、HIF-1α檢測：采用石蠟切片脫蠟至水，采用離子水進(jìn)行反復(fù)洗滌，加入牛奶液體封閉抗體，封閉時(shí)間為5 min，加入HSP70、HIF-1α抗體(鼠來源，ABCUM公司),37℃孵育 2 h，采用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，滴加熒光染色標(biāo)記的二抗抗體(購自abcum公司)，37℃孵育 30 min，加入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌，采用南京凱基生物制劑公司生產(chǎn)的顯色劑進(jìn)行顯色，封片，鏡下觀察。

5.免疫組化結(jié)果判定：HSP70、HIF-1α蛋白的陽性著色表達(dá)于細(xì)胞漿或細(xì)胞核，呈黃色、棕黃色、褐色表達(dá)。根據(jù)著色強(qiáng)度，0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為褐色、黑色；根據(jù)陽性細(xì)胞比例，陽性細(xì)胞數(shù)目所占比例≤10%為1分，陽性細(xì)胞所占比例11%～50%為2分，陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分，陽性細(xì)胞數(shù)所占比例>75%為4分；兩種積分相乘總分<3分為陰性，總分≥3分為陽性；總分<3分，用 “-”表達(dá)；總分為3～5分，用“+”表達(dá)；總分<為6～9分，用“++”表達(dá)；總分>9分，用“+++”表達(dá)。

結(jié)果

1.兩組妊娠婦女肝功能相關(guān)指標(biāo)比較:ICP組患者的血清GC、TBA、ALT、AST、TBIL水平均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.兩組妊娠婦女胎盤組織中HSP70、HIF-1α蛋白表達(dá)程度比較：ICP組患者的HSP70和HIF-1α蛋白表達(dá)程度和陽性表達(dá)率均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

3.不同病情ICP患者肝功能相關(guān)指標(biāo)比較：重度ICP組患者的血清GC、TBA、ALT、AST、TBIL水平均顯著高于輕度ICP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

4.不同病情ICP患者胎盤組織中HSP70、HIF-1α蛋白表達(dá)程度比較：重度ICP組患者的HSP70、HIF-1α蛋白表達(dá)程度顯著高于輕度ICP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表1 兩組妊娠婦女肝功能相關(guān)指標(biāo)比較

注：與對照組比較，*P<0.05

表2 兩組妊娠婦女胎盤組織中HSP70和HIF-1α蛋白表達(dá)程度比較 [例(%)]

注：兩組比較，*P<0.05

表3 不同病情ICP患者肝功能相關(guān)指標(biāo)比較

注：與輕度組比較，*P<0.05

表4 不同病情ICP患者胎盤組織中HSP70和HIF-1α蛋白表達(dá)程度比較 [例(%)]

注：兩組比較，*P<0.05

討論

ICP的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，膽道系統(tǒng)疾病、先天性遺傳易感基因的攜帶等，均可能影響到孕期血清中膽汁酸水平的升高和促進(jìn)ICP的發(fā)生。ICP能夠在下列幾個(gè)方面影響到孕產(chǎn)婦的臨床結(jié)局[5-6]：(1)ICP增加了孕產(chǎn)婦妊娠晚期肝功能損傷、凝血功能障礙或者多器官功能障礙的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；(2)ICP增加了胎兒宮內(nèi)窘迫的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致胎兒生長發(fā)育畸形的風(fēng)險(xiǎn)增加，胎兒宮內(nèi)生長受限或者新生兒窒息的發(fā)生率也明顯上升?，F(xiàn)階段臨床上長期的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，ICP的早期診斷水平較低，35%左右的孕產(chǎn)婦在診斷ICP時(shí)已合并有明顯的器官功能損傷[7]。本研究通過對于HSP70、HIF-1α蛋白的表達(dá)變化，不僅能夠?yàn)榕R床上ICP患者的診斷提供前期參考指標(biāo)，而且還能夠?yàn)镮CP的病情嚴(yán)重程度的評估提供依據(jù)。

HSP70是熱休克家族的重要成員，其能夠在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)或者自身性免疫損傷等方面發(fā)揮一定的作用。HSP70能夠誘導(dǎo)下游炎癥細(xì)胞如單核細(xì)胞或者中心粒細(xì)胞等的富集，導(dǎo)致患者細(xì)胞膜完整性的破壞[8]，增加細(xì)胞炎癥因子對胎盤絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞或者合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的浸潤，導(dǎo)致胎盤功能退化，影響到胎兒的供應(yīng)及血流的灌注[9]。 HIF-1α是缺氧誘導(dǎo)因子，其表達(dá)濃度的改變是影響到缺氧再灌注損傷的啟動(dòng)因子，能夠在加速胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體損傷，增加胎盤微血栓的形成方面發(fā)揮作用。HIF-1α還可以影響到肝細(xì)胞對于膽汁酸的代謝，導(dǎo)致膽汁酸的分解利用障礙，血清中膽汁酸水平的持續(xù)性上升可以導(dǎo)致孕產(chǎn)婦胎兒組織器官的直接損傷[10]。

CG、TBA、ALT、AST和TBIL等指標(biāo)是評估ICP患者肝功能損傷程度的重要指標(biāo)，相關(guān)指標(biāo)的上升往往提示患者肝臟細(xì)胞膜的破壞，肝臟代償功能的下降。本研究ICP患者血清中相關(guān)肝功能損傷指標(biāo)明顯上升，高于正常對照孕產(chǎn)婦，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與ICP患者體內(nèi)高膽汁酸代謝，導(dǎo)致患者肝臟細(xì)胞膜的氧化性損傷，或者與膽汁酸的直接對于肝臟細(xì)胞膜的促分解作用有關(guān)。ICP患者胎盤組織中HSP70、HIF-1α蛋白表達(dá)陽性率的上升，則提示HSP70、HIF-1α可能參與到了ICP患者病情持續(xù)性進(jìn)展過程中，二者的高表達(dá)能夠在下列幾個(gè)方面影響到ICP的母嬰不良妊娠結(jié)局[11-12]：(1)HSP70的表達(dá)，影響到胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的成熟及分化，導(dǎo)致濾過或者營養(yǎng)物質(zhì)交換功能的障礙；(2)HIF-1α蛋白的高表達(dá)，能夠加劇下游IL-6或者IL-10等細(xì)胞炎癥因子的高表達(dá)，促進(jìn)其對于胎盤血管的毒性損傷作用，同時(shí)高表達(dá)的HIF-1α蛋白還可以導(dǎo)致自然殺傷性T淋巴細(xì)胞對于臍動(dòng)脈的痙攣性損傷，引起臍動(dòng)靜脈血流灌注動(dòng)力學(xué)的紊亂。章易琳等[13- 14]在嚴(yán)重母嬰不良結(jié)局的ICP孕產(chǎn)婦的胎盤組織中檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，ICP胎盤組織中HSP70、HIF-1α蛋白等的異常表達(dá)，與胎盤功能、胎盤血管的阻力及胎兒宮內(nèi)生長受限等指標(biāo)均密切相關(guān)。但也有部分研究認(rèn)為，HSP70、HIF-1α蛋白的表達(dá)只有在中度或者重度ICP患者中才存在差異性的表達(dá)[4]，本研究與此存在一定的不同，可能與ICP患者的膽汁酸水平的差距、肝臟代償功能等的差異有關(guān)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)在不同嚴(yán)重程度的ICP患者中，HSP70、HIF-1α蛋白或者CG、TBA、ALT、AST、TBIL等肝功能指標(biāo)呈現(xiàn)出了明顯的線性表達(dá)差異，病情越為嚴(yán)重，相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)越高，臨床上可以通過評估HSP70、HIF-1α蛋白等，進(jìn)而為ICP的病情評估提供參考。

本研究的創(chuàng)新性在于探討了HSP70、HIF-1α蛋白等指標(biāo)在胎盤組織而非血清中的異常表達(dá)，并揭示了其與患者病情嚴(yán)重程度的關(guān)系。綜上所述,ICP患者血清CG、TBA、ALT、AST、TBIL水平及胎盤組織中HSP70、HIF-1α蛋白表達(dá)水平均顯著升高，并且與病情程度密切相關(guān)。