李志強(qiáng)， 魏艷玲， 高靜

(河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院 病理科， 河北 張家口 075100)

宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)高居女性惡性腫瘤第三位， 近年來(lái)發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[1]。腫瘤的分化和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤死亡率升高的重要原因，研究發(fā)現(xiàn)， 80.0%以上宮頸癌死亡病例是腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲所致[2]，因此明確宮頸癌的轉(zhuǎn)移和侵襲病理生理機(jī)制，對(duì)于早期明確診斷和提高治療及預(yù)后質(zhì)量至關(guān)重要。近年來(lái)，隨著宮頸癌分子生物學(xué)研究的不斷深入，多項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)在宮頸癌的診斷、預(yù)后評(píng)估及靶向治療等方面受到高度關(guān)注[3]。研究發(fā)現(xiàn)，TESTIN和腦惡性腫瘤缺失基因1(DMBT1)在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌及肝癌等多種癌組織中表達(dá)水平較正常組織明顯下降[4-6]，提示TESTIN和DMBT1可能與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但關(guān)于TESTIN及DMBT1與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的研究較少，本研究通過(guò)分析不同病理特征的宮頸癌組織中TESTIN及DMBT1表達(dá)情況，探討TESTIN及DMBT1蛋白表達(dá)與宮頸癌病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般臨床資料及試劑

1.1.1一般臨床資料 選取2016年1月～2018年4月收治的47例宮頸癌患者作為宮頸癌組(包括宮頸癌Ⅰ期26例、宮頸癌Ⅱ期21例)，同期宮頸內(nèi)瘤樣病變(CIN)患者40例作為CIN組(包括CINⅠ級(jí)21例、CINⅡ～Ⅲ級(jí)19例)，同期行子宮全切術(shù)的子宮肌瘤患者40例(術(shù)后病理排除宮頸病變)作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合《2016年NCCN宮頸癌臨床實(shí)踐指南》[7]中宮頸癌或CIN臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)、且經(jīng)兩位資歷豐富的病理醫(yī)師確診，(2)均行廣泛性全子宮切除術(shù)聯(lián)合盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)治療，(3)均經(jīng)2013年版國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)[8]分期標(biāo)準(zhǔn)證實(shí)為Ia～I(xiàn)Ib期，(4)手術(shù)前均未接受放化療或其他療法治療，(5)研究對(duì)象或家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并子宮內(nèi)膜癌等其他類(lèi)型惡性腫瘤患者，(2)合并嚴(yán)重的心腦血管、肝腎肺等實(shí)質(zhì)性臟器組織疾病患者，(3)合并嚴(yán)重的全身性疾病患者。宮頸癌組患者26～69歲、平均 (46.25±8.59)歲，CIN組23～66歲、平均 (45.90±8.37)歲，對(duì)照組22～70歲、平均(46.58±8.81)歲。3組研究對(duì)象的一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具可比性。該研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑 鼠抗人單克隆TESTIN抗體及DMBT1抗體購(gòu)自黃石研科生物科技有限公司，免疫組織化學(xué)SP法試劑盒及PBS緩沖液購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.2 方法

于手術(shù)時(shí)收集3組研究對(duì)象的宮頸組織，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)TESTIN及DMBT1表達(dá)，將宮頸組織經(jīng)固定、脫水、透明、包埋、切片等步驟完成切片，再將切片于60 ℃烘箱中烘烤30 min，經(jīng)過(guò)二甲苯和酒精梯度脫蠟、脫水，利用枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，依次加入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和封閉液進(jìn)行封閉20 min、甩干，加入一抗工作液(TESTIN及DMBT1抗體均按1∶100稀釋)孵育過(guò)夜，次日加入二抗孵育20 min，依次滴加ABC液和DAB顯色劑，最后加入蘇木精進(jìn)行復(fù)染，二甲苯和酒精梯度脫蠟、脫水后封片，鏡下觀察染色情況。結(jié)果判定[7-8]：高倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)，每個(gè)視野讀取細(xì)胞計(jì)數(shù)≥100個(gè)，每例涂片由兩名病理醫(yī)師共同計(jì)數(shù)并取平均值，對(duì)細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性表達(dá)率分別按設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分，再將二者分值相乘記為最終得分，細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分為棕褐色記3分、棕黃色記2分、淡黃色記1分及未著色記0分，細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率評(píng)分為陽(yáng)性表達(dá)率>75%記4分、51%≤～≤75%記3分、26%≤～≤50%記3分及1%≤～≤25%記3分，<1%記0分。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)比較3組宮頸組織中TESTIN級(jí)DMBT1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率，(2)分析不同分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不同病理類(lèi)型宮頸癌組織中的TESTIN及DMBT1表達(dá)水平，(3)采用Spearman法分析TESTIN及DMBT1表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TESTIN及DMBT1蛋白

由圖1和圖2可見(jiàn)，TESTIN及DMBT1在細(xì)胞胞漿和胞核中均有表達(dá)，在癌組織和癌前組織(CIN)中表達(dá)量少、在正常宮頸組織中表達(dá)較高，隨著宮頸癌的惡性程度的升高，TESTIN及DMBT1陽(yáng)性表達(dá)量均呈逐漸下降趨勢(shì)。表1結(jié)果顯示，宮頸癌組織中TESTIN及DMBT1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于CIN組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：A為對(duì)照，B為CIN Ⅰ級(jí)，C為CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)，D為宮頸癌Ⅰ期，E為宮頸癌Ⅱ期圖1 各組宮頸組織中TESTIN蛋白表達(dá)(SP,×200)Fig.1 Expression levels of TESTIN protein in normal tissues and cervical tissues

注：A為對(duì)照，B為CIN Ⅰ級(jí)，C為CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)，D為宮頸癌Ⅰ期，E為宮頸癌Ⅱ期圖2 各組宮頸組織中DMBT1蛋白表達(dá)(SP,×200)Fig.2 Expression levels of DMBT1 protein in normal tissues and cervical tissues

表1 各組宮頸組織中TESTIN及DMBT1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(n,%)Tab.1 The percentages of TESTIN and DMBT1 positive proteins in three groups of cervical tissues

(1)與宮頸癌組比較，P<0.05

2.2 宮頸癌組織中的TESTIN及DMBT1蛋白表達(dá)水平

表2結(jié)果顯示，低分化宮頸癌患者宮頸癌組織中TESTIN和DMBT1蛋白表達(dá)水平顯著低于中分化和高分化患者(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者顯著低于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，鱗癌型宮頸癌患者雖較腺癌型患者有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 TESTIN和DMBT1表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征相關(guān)性

Spearman分析顯示，TESTIN在組織中的表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(r=-0.155，P=0.044)、脈管瘤栓(r=-0.183，P=0.010)呈負(fù)相關(guān)，與分化程度(r=0.172，P=0.016)呈正相關(guān)；DMBT1在組織中的表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(r=-136，P=0.027)呈負(fù)相關(guān)，與分化程度(r=0.214，P=0.009)呈正相關(guān)。

表2 不同病理特征宮頸癌組織中TESTIN和DMBT1表達(dá)Tab.2 TESTIN and DMBT1 expression levels in cervical cancer tissues with different pathological features

3 討論

目前，基于宮頸癌病因?qū)W、臨床病理資料與療效及預(yù)后相關(guān)性報(bào)道較多，但越來(lái)越多研究顯示，分子生物學(xué)指標(biāo)在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其不僅可預(yù)測(cè)患者病情程度和臨床預(yù)后結(jié)局，并有望為宮頸癌的靶向治療提供標(biāo)準(zhǔn)參考[9]。癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)[10]。DMBT1基因由缺失純合子的成纖維管細(xì)胞瘤細(xì)胞系中克隆而來(lái)，是SRCR超家族的一份子[11]。研究發(fā)現(xiàn)，DMBT1基因與人體的免疫防御、黏膜保護(hù)以及上皮細(xì)胞分化有著密切聯(lián)系[12]。同時(shí)，大量研究也表明，DMBT1基因在多種腫瘤組織(如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌及腎癌等)中呈異常低表達(dá)，推測(cè)其可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是候選的抑癌基因[13-15]。TESTIN基因廣泛表達(dá)于人體正常組織，但在多種腫瘤組織中表達(dá)缺少，提示其可能也是一個(gè)候選抑癌基因[16]。目前，DMBT1和TESTIN基因在宮頸癌的表達(dá)情況在國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，本研究通過(guò)對(duì)檢測(cè)分析DMBT1和TESTIN在宮頸癌組織的表達(dá)情況，進(jìn)一步探究其抑癌作用。

本研究結(jié)果顯示，TESTIN和DMBT1在胞漿和胞核中均有表達(dá)，在癌組織和癌前組織中表達(dá)量少，正常宮頸組織中表達(dá)較高，隨著惡性程度的升高，陽(yáng)性表達(dá)量均呈逐漸下降趨勢(shì)。宮頸癌組織中TESTIN和DMBT1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于CIN組和對(duì)照組(P<0.05)。同時(shí)，在不同分化程度的宮頸癌組織中對(duì)比也發(fā)現(xiàn)，低分化宮頸癌患者癌組織中TESTIN和DMBT1表達(dá)明顯低于中、高分化宮頸癌患者(P<0.05)；對(duì)是否具有淋巴轉(zhuǎn)移情況分析發(fā)現(xiàn)，TESTIN和DMBT1表達(dá)有轉(zhuǎn)移患者明顯低于無(wú)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)；而對(duì)不同病理類(lèi)型宮頸癌組織對(duì)比發(fā)現(xiàn)，腺癌與鱗癌2組TESTIN和DMBT1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外單因素分析顯示，宮頸癌組織TESTIN和DMBT1陰性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和低分化明顯相關(guān)。以上結(jié)果提示，TESTIN和DMBT1基因在宮頸癌中可能起到抑癌作用，與宮頸癌惡性程度呈負(fù)相關(guān)，這與其他腫瘤研究結(jié)果一致[17-18]。

綜上所述，宮頸癌組織中TESTIN和DMBT1存在明顯缺失，TESTIN和DMBT1蛋白低表達(dá)，且與宮頸癌分期、轉(zhuǎn)移及侵襲密切相關(guān)，可作為宮頸癌惡性進(jìn)程及預(yù)后評(píng)估的重要分子生物學(xué)指標(biāo)。