王葉青 丁慧璞 徐 旭 程 丹 王志江 劉利萍*

（1 浙江萬里學院生物與環(huán)境學院 浙江寧波315100 2 寧波大央工貿(mào)有限公司 浙江寧波315000 3 浙江醫(yī)藥高等?？茖W校制藥工程學院 浙江寧波315100）

精油也稱揮發(fā)油，是一類存在于植物體中有芳香氣味，在常溫下能揮發(fā)，可隨水蒸氣蒸餾出的油狀液體的總稱。廣泛應用于化妝品、香料以及醫(yī)藥工業(yè)[1]。許多天然植物精油有抑菌或殺死微生物的特性[2-4]。梅林等[5]測定了八角茴香精油對痢疾桿菌、金葡菌、白喉桿菌、傷寒桿菌的MIC 值，顯示八角茴香精油對這些微生物有較強的抑制作用。秦文文[6]研究了茶樹精油對5 種供試菌抑菌效果均屬于中度敏感，測得大腸埃希菌和白色葡萄球菌的MIC 為1.0%，金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、綠膿桿菌的MIC 分別為1.2%，1.4%，2.0%。黃妙玲等[7]研究了金盞花精油對皮膚有很好的抗炎及促進細胞再生作用，對青春痘、皮膚疤痕等都有治療效果。

枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，芽孢是產(chǎn)芽孢細菌生長發(fā)育后期菌體內(nèi)形成的一個圓形或橢圓形、厚壁、折光性強、具抗逆性的休眠體，它有驚人的耐高溫能力和抗輻射能力。由于芽孢桿菌能產(chǎn)生很強抗逆性的芽孢，因此是在食品工業(yè)中經(jīng)常遇到的污染菌，它們可以引起果蔬、糧食、乳制品、肉類、魚類、禽類、蛋類以及罐頭食品變質(zhì)，導致一些食源性疾病和食物中毒[8]。

在食品工業(yè)生產(chǎn)中，長期使用山梨酸鉀、苯甲酸鈉等人工合成食品防腐劑?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，它們對食品的口感及人體健康有不良影響，因此要求嚴格限制其在食品中的用量[9]。開發(fā)高效、安全、穩(wěn)定且廉價的新型防腐劑，具有重要意義。天然防腐劑的研究和開發(fā)利用成為當今食品工業(yè)的一個熱點[10]。天然防腐劑對人體健康無害，有些天然防腐劑已達到或超過人工合成防腐劑的效果。

本試驗選擇自然界常見的8 種植物精油測定其對枯草芽孢桿菌的抑制活性，并篩選出其中對枯草芽孢桿菌抑制效果較好的植物精油，測定其最低抑菌濃度，按照最低抑菌濃度復配植物精油，利用其協(xié)同增效作用以達到更好的抑菌效果。對復配植物精油的機理進行探究，為植物精油在食品中的應用提供理論基礎(chǔ)，為天然防腐劑在食品貯藏保鮮中的應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物精油：菊花精油、冬青精油、金盞花精油、八角茴香精油、香蜂草精油、佛手柑精油、茉莉精油和野番茄精油，通過水蒸氣蒸餾法制得，于低溫4 ℃避光保存。均由寧波大央工貿(mào)有限公司提供。

尼泊金乙酯 （配制質(zhì)量濃度為50 μg/mL 使用），國藥集團。

供試菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），于-20 ℃，斜面保存，由浙江萬里學院微生物實驗室惠贈。

1.2 微生物培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：用于細菌培養(yǎng)。牛肉膏3 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，瓊脂1.5～2.0 g（液體培養(yǎng)基不含瓊脂），水100 mL，pH 7.0～7.2（使用1.0 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 值）。

1.3 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD 型凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-75SII 型壓力蒸汽滅菌器、BSP-150型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；SKY-200B 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海蘇坤實業(yè)有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 供試菌懸液制備 從活化的菌體斜面上挑取菌體接種于相應的液體培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。分別吸取供試菌液0.5 mL，加入無菌水倍比稀釋到105～106CFU/mL，備用。

1.4.2 8種植物精油對枯草芽孢桿菌的抑制活性取6 支50 mL 錐形瓶（編號1～6），1 號瓶中加入20 mL 培養(yǎng)基為空白；6 號瓶中加入10 mL 培養(yǎng)基與10 mL 菌懸液為陰性對照；2～5 號瓶中加入10 mL 菌懸液，再依次加入2.0，5.0，10，20 μL 植物精油，再加入培養(yǎng)液至20 mL。置于37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察培養(yǎng)液，如出現(xiàn)渾濁，表明有菌生長；澄清透明，表明加入的精油有抑菌作用[11]。

1.4.3 最低抑菌濃度（MIC）測定 選取1.4.2 節(jié)中抑菌效果好的植物精油，采用倍比稀釋法測定其MIC。取9 支50 mL 錐形瓶（編號1～9），1 號瓶中加入20 mL 培養(yǎng)基為空白；9 號瓶中加入10 mL 培養(yǎng)基與10 mL 菌懸液為陰性對照；2～8 號瓶中加入10 mL 菌懸液，再依次加入1.25，2.5，5.0，10，20，40，50 μL 植物精油，同時以同劑量的50 μg/mL 尼泊金乙酯作陽性對照，再加入培養(yǎng)基至20 mL。置于37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，測定各試管中培養(yǎng)液在600 nm 波長處的透光率（細菌在一定條件下，可以在其相應的液體培養(yǎng)基中生長并能夠使培養(yǎng)基變渾濁，如果在其中加入具有抑菌效果的植物精油，則能使培養(yǎng)基保持澄清透明）。在透光率40%～60%范圍內(nèi)，確定對應試管的植物精油濃度為對應菌種的最低抑菌濃度。

分別取這4 種植物精油MIC 下的菌液200 μL 于固體培養(yǎng)基中涂布，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（24 h，37 ℃），觀察枯草芽孢桿菌的生長情況。

1.4.4 復配植物精油對枯草芽孢桿菌的抑制性選出1.4.2 節(jié)中抑菌效果較好的菊花精油、八角茴香精油、金盞花精油及冬青精油為因變量，MIC 為各因素的最高水平，以菌液的透光率為響應值，做Box-Behnken 響應面優(yōu)化試驗，按照1.4.3 節(jié)的方法測定復配精油的抑菌活性，確定菊花精油、八角茴香精油、金盞花精油以及冬青精油的最佳組合。

1.4.5 復配精油對枯草芽孢桿菌生長曲線的影響 將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取出部分菌液，并分為對照組和復配精油試驗組。對照組是將菌液直接用相應的液體培養(yǎng)基稀釋到菌體個數(shù)為105～106CFU/mL；復配精油試驗組是將菌液加到含復配精油濃度為最佳配方的液體培養(yǎng)基中，并使得菌體個數(shù)為105～106CFU/mL。將對照組和復配精油組繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 h 取樣，離心收集菌體，重懸于2 mL 生理鹽水中測A600nm值，制作對照組生長曲線和復配精油試驗組生長曲線[12]，分析復配精油的抑菌特性。

2 結(jié)果與分析

2.1 8 種植物精油抑菌活性的測定結(jié)果

當精油含量在1 μL/mL 內(nèi)，8 種植物精油對枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制效果，依次為：八角茴香精油＞菊花精油、金盞花精油＞冬青精油＞茉莉精油、佛手柑精油＞香蜂草精油、野番茄精油。

表1 8 種植物精油對枯草芽孢桿菌的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activity of eight plant essential oils against the Bacillus subtilis

2.2 4 種植物精油最低抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果

根據(jù)2.1 節(jié)的試驗結(jié)果，選取其中4 種對枯草芽孢桿菌抑制活性效果較好的精油，測定其最低抑菌濃度。

由表2可知，這4 種植物精油對枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別是八角茴香（0.25 μL/mL）＞金盞花（0.5 μL/mL）≈菊花（0.5 μL/mL）＞冬青精油（1.0 μL/mL），其中八角茴香精油的抑菌性比陽性對照尼泊金酯還強，小于尼泊金酯的MIC 值為0.5 μL/mL。

這4 種植物精油在MIC 下對枯草芽孢桿菌都有很好的抑制作用，金盞花精油、菊花精油和冬青精油在MIC 時，殺死了絕大多數(shù)枯草芽孢桿菌及其芽孢，而八角茴香精油在MIC 時，枯草芽孢桿菌及其產(chǎn)生的芽孢都被殺死。

2.3 復配植物精油抑菌活性測定結(jié)果

根據(jù)表4得到植物精油復配對枯草芽孢桿菌生長（透光率）影響規(guī)律的二次多項擬合方程為：

透光率（%）=86.17+5.64A+10.72B+9.58C+12.34D-4.35AB+4.39AC+5.33AD-8.53BC-1.40BD-4.28CD+0.91A2-7.58B2-11.56C2-10.67D2，R2=0.9544。

所建立的回歸模型P＜0.001，說明模型極顯著。A，B，C，D，BC 的P＜0.05，說明菊花精油（B）、八角茴香精油（D）、金盞花精油（C）、冬青精油（A），以及菊花精油和金盞花精油復配（BC）對枯草芽孢桿菌的生長抑制有顯著影響。其影響大小次序為：菊花精油（B）、八角茴香精油（D）>金盞花精油（C）>冬青精油（A）>菊花精油和金盞花精油復配（BC）。從試驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計學分析可知，菊花精油和金盞花精油存在相互作用，兩種精油復配有相互增效作用。

圖2表示冬青精油0.5 μL/mL 和八角茴香精油0.13 μL/mL 時，菊花精油和金盞花精油對透光率的響應面影響。菊花精油和金盞花精油對枯草芽孢桿菌的生長抑制存在顯著協(xié)同增效作用，且隨著菊花精油和金盞花精油濃度的升高對枯草芽孢桿菌的抑制作用變強，當濃度達到一定時趨于平穩(wěn)。

通過軟件Design-Expert 8.0.6 分析得枯草芽孢桿菌生長抑制的最佳條件是：冬青精油為0.61 μL/mL、菊花精油為0.44 μL/mL、金盞花精油為0.24 μL/mL、八角茴香精油為0.17 μL/mL 時，透光率預測最大值為93.45%。按照上述配方，進行3次重復試驗，測定得到透光率的平均值為91.05%±1.81%（91.31%，93.24%，89.7%），與預測值接近，說明此響應面法得到的回歸模型可靠。

表2 4 種植物精油的最低抑菌濃度（MIC）Table 2 Minimum inhibitory concentration （MIC） of four kinds of essential oils

圖1 4 種植物精油在MIC 時枯草芽孢桿菌的生長情況Fig.1 The growth of Bacillus subtilis at MIC of four kinds of essential oils

表3 4 種植物精油復配的響應面抑菌試驗結(jié)果Table 3 Response surface test results of four kinds of essential oils complexed

表4 方差分析表Table 4 Variance analyses

圖2 菊花精油和金盞花精油對枯草芽孢桿菌的響應面分析Fig.2 Response surface analysis of chrysanthemum essential oil and calendula essential oil to Bacillus subtilis

2.4 復配精油對枯草芽孢桿菌生長曲線的影響

按照2.3 節(jié)得到的抑制枯草芽孢桿菌生長的最佳精油配方進行復配，冬青精油為0.61 μL/mL，菊花精油為0.44 μL/mL，金盞花精油為0.24 μL/mL，八角茴香精油為0.17 μL/mL，研究復配植物精油對枯草芽孢桿菌生長曲線的影響。

由圖3可知，經(jīng)復配精油處理過的枯草芽孢桿菌菌種生長情況與對照組相比較，生長緩慢，最終的菌體量不及正常生長量的一半。精油復配表現(xiàn)出對微生物生長抑制的協(xié)同增效作用，這與韓軍等[11]研究的肉桂、大蒜、丁香花蕾和生姜精油復配后對單核增生李斯特氏菌的抑菌增效一致。

圖3 復配精油對枯草芽孢桿菌生長曲線的影響Fig.3 The effect of compound essential oil on growth curve of Bacillus subtilis

從圖3可以判斷復配精油主要抑制了枯草芽孢桿菌對數(shù)生長期的分裂和繁殖，使得活菌數(shù)明顯下降，無法達到正常的生長高峰，并且很快進入衰亡期。

3 結(jié)論

開發(fā)植物性抑菌劑已成為當前食品保鮮的一個熱點。本試驗從8 種植物精油中篩選出了對抗逆性極強的枯草芽孢桿菌有抑菌效果的4 種植物精油，分別是金盞花精油、菊花精油、冬青精油和八角茴香精油，這4 種植物精油對枯草芽孢桿菌的MIC 值顯示，八角茴香精油的抗菌性強于陽性對照尼泊金酯。通過響應面試驗發(fā)現(xiàn)當冬青精油0.5 μL/mL、八角茴香精油0.13 μL/mL 時，菊花精油和金盞花精油對枯草芽孢桿菌存在協(xié)同增效作用；對枯草芽孢桿菌抑菌效果最好的復配精油比例為冬青精油0.61 μL/mL+菊花精油0.44 μL/mL+金盞花精油0.24 μL/mL+八角茴香精油0.17 μL/mL 時，復配精油能有效抑制枯草芽孢桿菌數(shù)的生長，其透光率達到91.05%±1.81%。本研究為天然防腐劑的研究提供了一個新的思路，可以利用植物精油經(jīng)過可行性加工，生產(chǎn)一種能用作于食品保藏、防腐的天然無毒的生物防腐劑，這對植物精油的進一步開發(fā)利用有一定的意義。