楚曉曉，楊 勇，李雙云，夏 陽，周繼磊，劉盛芳，屈 星，龐彩紅

（1.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省林木遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；4.平?jīng)雎殬I(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 平?jīng)?744000；5.山東省林木種苗和花卉站，山東 濟(jì)南 250014）

槐Sophora japonica為豆科Leguminosae槐屬Sophora落葉喬木樹種。原產(chǎn)中國(guó)，現(xiàn)南北各省區(qū)廣泛栽培，華北和黃土高原尤為多見，對(duì)土壤要求不嚴(yán)，適應(yīng)能力強(qiáng)，在石灰性、酸性及輕鹽堿土上，甚至在山區(qū)水少的地方均可正常生長(zhǎng)。此外槐冠大蔭濃，具有抗污染，耐煙塵，抗風(fēng)等特點(diǎn)，是良好的遮蔭樹和行道樹，槐的花、枝、果實(shí)均可入藥，具有良好的開發(fā)利用前景[1-2]。

山東省古槐樹的數(shù)量居所有古樹名木之首[3]，絕對(duì)數(shù)量多，古樹樹齡長(zhǎng)（300～1 800a），分布范圍較廣，加之當(dāng)時(shí)的交通不發(fā)達(dá)，使古槐樹的基因型多樣性成為可能。另外，古樹歷經(jīng)數(shù)百年乃至千年自然環(huán)境的考驗(yàn)存活下來，表明其對(duì)逆境具有良好的抵抗能力，因此開展古槐樹種質(zhì)資源的調(diào)查、收集、多樣性分析具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，也為開展槐逆境脅迫適應(yīng)機(jī)制、高抗種質(zhì)材料早期診斷評(píng)價(jià)與優(yōu)選技術(shù)研究提供材料，為槐雜交育種和分子育種奠定基礎(chǔ)，為新品種的選育提供種質(zhì)背景。

近年來對(duì)槐研究多集中在催芽[4]、扦插[5-6]、嫁接[7-8]，組培[9]等方面，對(duì)葉表型多樣性分析還未見報(bào)道。葉片是高等植物進(jìn)行光合、呼吸及蒸騰作用的主要器官，而葉外部形態(tài)特征與該植物的生理營(yíng)養(yǎng)及其所在的生態(tài)地理因子有關(guān)[10]，其表型的變化將直接影響植物體的一切生理活動(dòng)，因此葉表型性狀多樣性是遺傳物質(zhì)多樣性的具體表現(xiàn)，是進(jìn)行遺傳多樣性研究最基本、最重要的組成部分之一[11]。本試驗(yàn)對(duì)72份古槐樹種質(zhì)葉表型性狀遺傳多樣性進(jìn)行分析研究，為槐的種質(zhì)資源收集保存、鑒定分類、良種選育、栽培研究及開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

72份古槐樹種質(zhì)（樹齡均大于300年），來源于臨沂（LY）、煙臺(tái)（YT）、棗莊（ZZ）、淄博（ZB）四個(gè)地級(jí)市的不同縣、市、區(qū)，每個(gè)地級(jí)市18個(gè)無性系，2011年春天收集古樹上長(zhǎng)勢(shì)好，無蟲無病的枝條，于當(dāng)年四月底五月初進(jìn)行嫁接，選取帶有2～3個(gè)飽滿芽的接穗，嫁接于1年生的實(shí)生苗砧木上，每個(gè)無性系嫁接10株，嫁接成活植株定植于山東文峰集團(tuán)（威海市）苗圃（121°98′E，37°31′N），2012年定植。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集2016年8月，每份種質(zhì)選取正常生長(zhǎng)的植株3株，每株外圍取4個(gè)成熟枝（不同方向），從成熟枝條中部選取發(fā)育正常的一枝復(fù)葉，共計(jì)12個(gè)復(fù)葉，用于小葉數(shù)的統(tǒng)計(jì)和葉軸長(zhǎng)的測(cè)定；選取復(fù)葉上（從頂葉數(shù)）第三對(duì)小葉，每份種質(zhì)共計(jì)24片葉片用于小葉葉片性狀的觀察與數(shù)據(jù)的測(cè)定。

1.2.2 測(cè)定性狀小葉葉片的干質(zhì)量（X1）、鮮質(zhì)量（X2）、葉脈角（X3）、葉周長(zhǎng)（X4）、葉面積（X5）、葉厚（X7）、葉長(zhǎng)（X8）、葉寬（X9）、葉形指數(shù)（X10）、小葉數(shù)（X11）共10項(xiàng)，此外還有復(fù)葉葉軸長(zhǎng)（X6），共計(jì)11個(gè)性狀。

1.2.3 測(cè)量方法葉厚測(cè)定 用游標(biāo)卡尺測(cè)量葉片厚度，6片一組（24片葉片隨機(jī)分成4組，每組6片），測(cè)量后取平均值（精確到0.01mm）[12]；鮮質(zhì)量測(cè)定：樣品采集后立即用METTLER TOLEDO（JE703CE）電子天平稱其鮮質(zhì)量（精確到0.01g）；干質(zhì)量測(cè)定：將葉片置于烘箱中烘至恒質(zhì)量，METTLER TOLEDO（JE703CE）電子天平稱其干質(zhì)量（精確到0.01g）；葉軸長(zhǎng)測(cè)定：利用直尺測(cè)量葉軸的長(zhǎng)度（精確到0.01 cm）；小葉數(shù)測(cè)定：通過目測(cè)進(jìn)行觀測(cè)（片）；葉形指數(shù)測(cè)定：是葉長(zhǎng)與葉寬的比值[13]。葉長(zhǎng)、葉寬、葉周長(zhǎng)、葉面積、葉脈角測(cè)定：利用EPSON V370掃描儀，獲取圖像，將待測(cè)葉片平鋪到掃描儀面板上，蓋上玻璃蓋板，使葉片完全平整展開，葉正面朝下；圖像類型為48位全彩，分辨率為300 dpi，文稿大小寬度215.9 mm，高度297.2 mm，圖像格式為bmp格式[14]。Digmizer4.2圖像分析軟件對(duì)掃描圖像進(jìn)行分析，以圖片高度297.2 mm設(shè)置比例尺，測(cè)量葉面積（0.01 cm2）、葉周長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉寬精確到（0.01 cm）；葉脈角利用軟件上的角度測(cè)量其葉脈角。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel對(duì)原始數(shù)據(jù)的平均值、最大值、最小值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)等進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)；用SPASS軟件進(jìn)行方差分析、主成成分分析、相關(guān)性分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 古槐樹葉片性狀的多樣性

數(shù)量性狀可用來分析遺傳變異的水平[15]，一般認(rèn)為變異系數(shù)大于10%就說明樣本間的差異較大，變異系數(shù)越大，個(gè)體之間的差異也就越大，越有利于對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定、評(píng)價(jià)和利用[14]。對(duì)72份古槐樹葉片的11個(gè)性狀指標(biāo)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1。由表1可知，古槐樹葉片的干質(zhì)量、鮮質(zhì)量、葉脈角、葉周長(zhǎng)、葉面積、葉軸長(zhǎng)、葉厚、葉長(zhǎng)、葉寬、葉形指數(shù)、小葉數(shù)的平均值分別為0.10 g，0.28 g，53.15°，16.40 cm，10.95 cm2，15.31 cm，0.28 mm，6.06 cm，2.49 cm，2.47，14片。變異系數(shù)11.88%～39.10%，平均變異系數(shù)23.26%。在所測(cè)種質(zhì)葉片性狀中，鮮質(zhì)量最大為0.77 g，最小為0.05 g，變異范圍最大，變異系數(shù)高達(dá)39.10%；葉厚的變異系數(shù)最低，11.88%，古槐樹的葉片性狀變異系數(shù)從小到大依次為：葉厚＜葉脈角＜葉形指數(shù)＜葉軸長(zhǎng)＜小葉數(shù)＜葉寬＜葉長(zhǎng)＜葉周長(zhǎng)＜葉面積＜葉干質(zhì)量＜葉鮮質(zhì)量。經(jīng)過F值檢驗(yàn)，11個(gè)葉片性狀均達(dá)到了極顯著差異（P＜0.01），表明古槐樹葉片表型數(shù)量性狀變異范圍較大，差異顯著，遺傳變異水平較高，遺傳多樣性較豐富[16-17]。

表1 古槐樹葉表型性狀變異分析Table1 Analysisonphenotypic trait variation of old S.japonicaleaves

2.2 古槐樹葉片不同性狀間的相關(guān)性

相關(guān)性分析是指對(duì)兩個(gè)或多個(gè)具備相關(guān)性的變量元素進(jìn)行分析，衡量?jī)蓚€(gè)變量因素的相關(guān)密切程度。對(duì)72份古槐樹種質(zhì)葉片性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2。

表2 葉片不同性狀間的相關(guān)性分析Table2 Correlation analysis ondifferent leaf traits

由表2可知，葉面積與干質(zhì)量、鮮質(zhì)量、葉周長(zhǎng)的相關(guān)系數(shù)達(dá)到了顯著性正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.63，0.83，0.68。葉寬與干質(zhì)量、鮮質(zhì)量、葉脈角、葉周長(zhǎng)、葉面積、葉長(zhǎng)達(dá)到了極顯著（P＜0.01）和顯著（P＜0.05）正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.56，0.72，0.10，0.58，0.88，0.61。葉長(zhǎng)與干質(zhì)量、鮮質(zhì)量、葉周長(zhǎng)、葉面積存在顯著或極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.51，0.67，0.83，0.77，葉周長(zhǎng)與小葉數(shù)、鮮質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.43，0.58。葉形指數(shù)與葉周長(zhǎng)、葉長(zhǎng)之間存在極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.30，0.48。小葉數(shù)與葉軸長(zhǎng)之間的相關(guān)和干質(zhì)量與鮮質(zhì)量之間的相關(guān)存在極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.63和0.60。另外，葉寬與葉面積相關(guān)系數(shù)達(dá)到極顯著，其相關(guān)系數(shù)最高0.88。結(jié)果顯示，不同性狀間存在一定的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)表明基于一個(gè)性狀的選擇也可能同時(shí)改良另一個(gè)性狀[18]，因此，在篩選與葉面積和葉周長(zhǎng)相關(guān)的品種時(shí)，可以參考葉長(zhǎng)和葉寬指標(biāo)。在對(duì)多個(gè)葉片性狀進(jìn)行改良時(shí)，應(yīng)關(guān)注性狀間的相關(guān)性并充分利用這些相關(guān)性來提高育種效率。

2.3 古槐樹葉片性狀的主成分分析

通過主成分分析將11個(gè)性狀進(jìn)行線性組合，構(gòu)成少數(shù)不相關(guān)的新變量，原變量中的信息被新變量代替。將原始數(shù)據(jù)矩陣經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行主成分分析，通過分析，能更清楚地顯示各性狀在葉片表型性狀多樣性構(gòu)成中的作用。

通過分析提取了4個(gè)主成分（表3），其累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到75.70%，包含了11個(gè)指標(biāo)的大部分信息，因此選取前4個(gè)主成分作為槐葉片性狀選擇的綜合指標(biāo)。在第1主成分中葉面積（PC1）占最高系數(shù)，方差貢獻(xiàn)率為37.85%，說明第1主成分是表示葉面積性狀的綜合因子；在第2主成分中葉軸長(zhǎng)（PC2）占有最高系數(shù)，方差貢獻(xiàn)率為15%，說明第2主成分是表示葉軸長(zhǎng)性狀的綜合因子；在第3主成分中葉形指數(shù)（PC3）占有最高系數(shù)，方差貢獻(xiàn)率為12.97%，說明第3主成分是表示葉形指數(shù)性狀的綜合因子；在第4主成分干重（PC4）占有最高系數(shù)，方差貢獻(xiàn)率為9.71%，說明第4主成分是表示干重的綜合因子。由此可知，槐葉片之間的差異主要表現(xiàn)為葉面積、葉軸長(zhǎng)、葉形指數(shù)、干重的不同。這些主成分在槐種質(zhì)分類上起到了重要作用，這些為槐新品種的選育過程中確定育種目標(biāo)，提供了依據(jù)。

表3 葉片性狀主成分分析Table3 Principal componentanalysisonleaf phenotypic traits

2.4 古槐樹綜合性狀的聚類分析

對(duì)72份古槐樹種質(zhì)葉表型的11個(gè)性狀的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并計(jì)算歐式距離，利用可變類平均連接法（組間）對(duì)其進(jìn)行聚類分析，將72份種質(zhì)完全區(qū)分開，說明葉片性狀能夠反映各樣品間的差異（圖1），來自同一種源的種質(zhì)沒有完全聚到一起，而是相互交叉。

由圖1表明，取閾值在22.5時(shí)，可分為3大類群，分別以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ命名（表4）。三大類群中，第Ⅰ類群包含2份種質(zhì)，約占總樣本數(shù)的2.8%，與其它兩類群相比較，葉周長(zhǎng)、葉長(zhǎng)的平均值最大，分別為21.09 cm，6.62 cm。第Ⅱ類群包含4份種質(zhì)，約占總樣本數(shù)的5.6%，與其它兩類群相比較，葉軸長(zhǎng)、葉寬、葉形指數(shù)、小葉數(shù)的平均值最大，為18.6 cm，2.82 cm，2.87，13片。其余66份材料的為第Ⅲ類群，約占總樣本數(shù)的91.6%，鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉脈角、葉面積的平均值最大，分別為0.29 g，0.10 g，53.59°，11.09 cm2。由此可見，72份古槐樹種質(zhì)資源具有各自的葉片表型特征。

圖1 葉片主要性狀聚類圖Figure1 Dendrogram of leaf traits of S.japonica

表4 各類群的平均值Table4 Mean phenotypic traits of different groups

3 結(jié)論與討論

種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究能夠?yàn)橛H本選擇、雜交組合配制以及遺傳改良提供有效的信息。形態(tài)學(xué)方法是植物遺傳多樣性研究最直接、基礎(chǔ)的方法，表型多樣性是在形態(tài)水平上對(duì)遺傳多樣性進(jìn)行的闡述[10,17,19-20]，很多學(xué)者先后利用表型性狀對(duì)種質(zhì)資源的多樣性進(jìn)行了分析[21-24]。如萬繼峰等[25]利用了12個(gè)葉片表型性狀進(jìn)行了橄欖Canarium album種質(zhì)表型多樣性研究，葉片表型變異系數(shù)為9.52%～25.09% ；徐斌等[18]利用14個(gè)葉片表型性狀對(duì)杜鵑紅山茶Camellia azalea的多樣性進(jìn)行分析，葉片表型變異系數(shù)為5.30%～47.00%，變異系數(shù)差值比較大。本次研究了72份古槐樹種質(zhì)11個(gè)葉片表型性狀的多樣性，其變異系數(shù)為11.88%～39.10%，且在0.01水平上達(dá)到了極顯著差異，結(jié)果說明葉片存在著豐富的多樣性，不同植物葉片的變異程度大小不同。宋偉栓[26]利用SRAP標(biāo)記分析了32份不同來源地的古槐樹遺傳距離和相似系數(shù)，遺傳距離在0.104 0～0.916 3之間，平均值為0.397 9，遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.333 3～0.888 9，平均值為0.619 0，說明古槐樹間存在一定程度的遺傳變異，但遺傳變異程度不是很大，這與葉片表型變異程度不太一致，可能與樣本量有一定關(guān)系，也可能是外部環(huán)境對(duì)表型的影響造成的。

基于表型性狀對(duì)古槐樹種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，在歐式距離為22.5時(shí)，72份槐種質(zhì)資源分為3大類群，發(fā)現(xiàn)同一地理種源的材料并未聚到一起，這與宋偉栓[26]的研究結(jié)果是一致的，說明聚類結(jié)果與各種源的地理位置分布不相符，即葉片性狀與種源無直接關(guān)系，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能與氣候、土壤、海拔、以及引種等因子對(duì)表型的影響有關(guān)，有待進(jìn)行進(jìn)一步研究。

古槐樹的數(shù)量居山東省所有古樹名木之首，存在時(shí)間長(zhǎng)，分布范圍較廣，基因型眾多，是具有創(chuàng)新利用潛力的種質(zhì)資源，由于古槐樹特定的文化底蘊(yùn)使得大量的古樹資源被保存下來，擴(kuò)大了種質(zhì)基因庫；另一方面對(duì)古槐樹表型性狀多樣性的分析，揭示了各個(gè)性狀之間的相關(guān)性，明確了各成分的貢獻(xiàn)率，為古槐樹表型新品種篩選與培育提供了參考，對(duì)于單株顯著特異性的，可進(jìn)一步研究挖掘，探尋潛在開發(fā)利用價(jià)值，同時(shí)，根據(jù)育種目標(biāo)選擇性狀互補(bǔ)的親本雜交組合，加速槐遺傳育種工作進(jìn)程，為種質(zhì)資源的保護(hù)、利用和創(chuàng)新提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也為古槐樹保護(hù)重點(diǎn)的劃定提供參考。