半乳糖流加對(duì)CHO細(xì)胞生長代謝及其表達(dá)的Fc融合蛋白糖基化的影響

肖政 范里 譚文松

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

哺乳動(dòng)物細(xì)胞尤其是CHO細(xì)胞因具備完善的糖基化等翻譯后修飾系統(tǒng)，成為目前表達(dá)藥用蛋白最重要的宿主細(xì)胞［1］。葡萄糖作為最主要的碳源物質(zhì)被廣泛運(yùn)用于CHO細(xì)胞的培養(yǎng)過程。作為主要負(fù)責(zé)CHO細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Glut-1具有很高的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性（Km=1-2 mmol/L），因此培養(yǎng)液中的葡萄糖會(huì)被快速轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿內(nèi)，經(jīng)糖酵解途徑生成大量丙酮酸。但丙酮酸進(jìn)入線粒體受到細(xì)胞的嚴(yán)格調(diào)控，因此多余的丙酮酸會(huì)經(jīng)乳酸脫氫酶作用轉(zhuǎn)化為乳酸［2］。乳酸的累積對(duì)細(xì)胞的生長、代謝和產(chǎn)物表達(dá)都會(huì)造成不利的影響［3］。糖基化作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，對(duì)藥用蛋白的生物學(xué)活性、溶解性以及半衰期等均發(fā)揮著重要作用［4］。唾液酸是蛋白類藥物糖基化修飾的一種重要形式。糖代謝過程中產(chǎn)生的UDP-半乳糖作為糖基單元參與唾液酸前體合成，隨后在細(xì)胞質(zhì)中合成唾液酸并經(jīng)載體轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體中，在唾液酸轉(zhuǎn)移酶的作用下將唾液酸連接到蛋白糖鏈末端的半乳糖上［5］。

半乳糖結(jié)構(gòu)與葡萄糖類似，不過它主要通過細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut-4（Km=10 mmol/L）進(jìn)入胞內(nèi)，在半乳糖激酶和1-磷酸半乳糖尿嘧啶轉(zhuǎn)移酶的作用下生成UDP-半乳糖［6］。UDP-半乳糖可以通過異構(gòu)酶的作用生成6-磷酸葡萄糖，作為碳源進(jìn)入糖酵解和TCA循環(huán)供給能量。由于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut-4的轉(zhuǎn)運(yùn)活性遠(yuǎn)低于Glut-1，因此半乳糖進(jìn)入細(xì)胞的速率也遠(yuǎn)小于葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的速率，培養(yǎng)液中乳酸的累積濃度也低于采用葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)過程。由此可見，半乳糖是葡萄糖理想的碳源替代物，具有顯著改善細(xì)胞代謝和提高蛋白質(zhì)量的可能。

本研究在補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程中，通過將補(bǔ)料培養(yǎng)基中的葡萄糖用等摩爾的半乳糖進(jìn)行替換考察以半乳糖為碳源的培養(yǎng)過程中CHO細(xì)胞的生長代謝和Fc融合蛋白的合成特性，了解營養(yǎng)物消耗和代謝副產(chǎn)物累積的規(guī)律，認(rèn)識(shí)半乳糖濃度對(duì)細(xì)胞生長、營養(yǎng)物消耗、乳酸代謝、產(chǎn)物合成和產(chǎn)物糖基化的影響，旨為建立高產(chǎn)、高質(zhì)的流加培養(yǎng)過程。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為表達(dá)Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株。傳代及基礎(chǔ)培養(yǎng)基由21.21 g/L的EX-CELL 302無血清培養(yǎng)基配制而成，并添加1.6 g/L的NaHCO3和2 mmol/L的Glutamine；補(bǔ)料培養(yǎng)基由我室自主研發(fā)，由多種氨基酸、維生素以及葡萄糖組成，從接種第2天起每天補(bǔ)加初始培養(yǎng)體積的3%，補(bǔ)料培養(yǎng)基中半乳糖等摩爾替代葡萄糖的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。本文中提到的試劑如未特殊說明均購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 種子細(xì)胞培養(yǎng) 從細(xì)胞庫中復(fù)蘇CHO細(xì)胞，以5.0×105cells/mL的活細(xì)胞密度接種于125 mL搖瓶中（Corning），接種體積為30 mL，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為110 r/min。每隔2 d進(jìn)行種子細(xì)胞傳代擴(kuò)增，傳代后活細(xì)胞密度控制在5.0×105cells/mL左右。

1.2.2 搖瓶內(nèi)補(bǔ)料培養(yǎng) 取指數(shù)生長期的CHO種子細(xì)胞經(jīng)1 000 r/min離心5 min，棄上清，用新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行重懸并以1.0×106cells/mL的起始密度接種于125 mL搖瓶內(nèi)，初始工作體積為40 mL，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為110 r/min，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為5%的CO2濃度和37℃的溫度，每個(gè)條件重復(fù)3次。每天取0.8 mL細(xì)胞液用于細(xì)胞計(jì)數(shù)、生長代謝和產(chǎn)物表達(dá)的檢測(cè)分析。

1.2.3 反應(yīng)器內(nèi)補(bǔ)料培養(yǎng) 反應(yīng)器內(nèi)的流加培養(yǎng)過程于 2 L的 BIOSTAT?B（B.Braun，Germany）反應(yīng)器中進(jìn)行。接種密度為1×106cells/mL，初始工作體積為1 L。培養(yǎng)條件設(shè)置：攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)置為80 r/min，溶氧為40%，pH設(shè)置為7.0，采用通入CO2或補(bǔ)加NaOH的方式進(jìn)行pH控制，培養(yǎng)溫度設(shè)定為37℃。

1.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù) 取樣0.1 mL 置于48孔板內(nèi)，稀釋到適宜密度后，加入等體積0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液進(jìn)行染色，吹打均勻后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.5 Fc融合蛋白表達(dá)量的檢測(cè) 采用的高效液相系統(tǒng)為Waters 2487 HPLC System（1525 Binary HPLC Pump ；717 plus Autosampler，2487 UV Detector，Waters）， 色 譜 柱 為 PA immune detection sensor cartridge（2.1 mm×3 cm，Applied Biosystem，USA），流動(dòng)相為A相：pH為7.4的PBS緩沖液，B相：pH為3的磷酸緩沖液。進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長為280 nm，A相前3 min以1 mL/min的流速平衡，第3分鐘到第12分鐘以1 mL/min的B相進(jìn)行等梯度洗脫。

1.2.6 培養(yǎng)液中氨基酸濃度的檢測(cè) 氨基酸濃度采用高效液相色譜（1525 Binary HPLC Pump；717 plus Autosampler；2475 Multi λ Fluorescence Detector，Waters）測(cè)定。樣品采用AccQ·Fluor 試劑（Waters）按使用說明進(jìn)行柱前衍生和檢測(cè)。

1.2.7 培養(yǎng)液中葡萄糖、氨和乳酸濃度的測(cè)定 葡萄糖、乳酸和氨濃度采用全自動(dòng)生化分析儀BioProfile 400 Analyzer（Nova Bio-medical，USA）測(cè)定。

1.2.8 培養(yǎng)液中半乳糖濃度的檢測(cè) 采用EnzyChromTMGalactose Assay Kit（BioAssay System），分別按相應(yīng)使用說明進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9 Fc融合蛋白的純化 Fc融合蛋白采用親和層析的方法進(jìn)行純化，層析柱為HiTrap Protein A HP（GE Healthcare），具體方法步驟見產(chǎn)品說明書。

1.2.10 總唾液酸含量的檢測(cè) 總唾液酸含量依據(jù)《中國藥典》（第三部）中間苯二酚的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.11 N -連接糖基化分布的檢測(cè) N-連接的糖基化分布采用Kim等［7］檢測(cè)方法。

1.2.12 數(shù)據(jù)分析 Fc融合蛋白的比生成速率qFcfusionprotein（mg/109cells/day）通過以下公式進(jìn)行計(jì)算：

其中P為Fc融合蛋白濃度（mg/L）；IVCC為活細(xì)胞密度對(duì)時(shí)間的積分（109cells·day/L）。

2 結(jié)果

2.1 半乳糖替代葡萄糖補(bǔ)料培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞生長代謝和產(chǎn)物表達(dá)的影響

2.1.1 對(duì)CHO細(xì)胞生長的影響 以1×106cells/mL的密度接種后細(xì)胞立即進(jìn)入指數(shù)生長期，6個(gè)培養(yǎng)過程在前期體現(xiàn)出相似的生長趨勢(shì)，平均比生長速率約為0.73 day-1，96 h后細(xì)胞生長明顯減慢（圖1）。96 h后，GF5細(xì)胞出現(xiàn)快速死亡，168 h后其活細(xì)胞密度跌至3.88×106cells/mL，活性降為28.8%。同樣，GF4過程（80%替代比例）在192 h也出現(xiàn)了快速死亡的現(xiàn)象，240 h時(shí)其活細(xì)胞密度僅為2.16×106cells/mL，活性僅為26.3%，而其他培養(yǎng)過程細(xì)胞均維持較好的活性，同時(shí)培養(yǎng)終點(diǎn)時(shí)的活細(xì)胞密度也維持在9×106cells/mL左右。

圖1 補(bǔ)料培養(yǎng)基中半乳糖替代對(duì)細(xì)胞生長的影響

2.1.2 對(duì)CHO細(xì)胞代謝的影響 代謝方面，GF5過程葡萄糖在接種后48 h即消耗至零。隨著半乳糖替代比例的降低，葡萄糖耗竭的時(shí)間依次推后，GF4在96 h時(shí)葡萄糖濃度跌至0 mmol/L，GF3在120 h時(shí)葡萄糖濃度跌至0 mmol/L。而0%-60%半乳糖替代范圍內(nèi)由于補(bǔ)料培養(yǎng)基中的葡萄糖被替代程度更低，足以滿足細(xì)胞對(duì)葡萄糖的需求，因此GF2的葡萄糖濃度在整個(gè)培養(yǎng)過程中都維持在10-15 mmol/L之間，Con和GF1的葡萄糖濃度則是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而不斷升高，出現(xiàn)逐漸累積的現(xiàn)象（圖2-A）。

與葡萄糖代謝對(duì)應(yīng)的，48 h葡萄糖濃度跌至0 mmol/L后，GF5的乳酸生成速率比開始明顯降低，72 h后乳酸由生成轉(zhuǎn)化為消耗狀態(tài)，最終到144 h其濃度跌至16.4 mmol/L。GF4也是當(dāng)96 h葡萄糖耗竭時(shí)，乳酸被重新利用，最終減少至20 mmol/L左右。雖然GF3后期的葡萄糖濃度也跌至0 mmol/L，但并沒有引起的乳酸的再利用。其他幾組由于未出現(xiàn)葡萄糖耗竭的情況，乳酸濃度都隨著培養(yǎng)過程的進(jìn)行而不斷升高，最終達(dá)到了45 mmol/L左右，3組之間的乳酸代謝沒有顯著性差異（圖2-B）。以上結(jié)果說明，在葡萄糖充足的情況下，CHO細(xì)胞以利用葡萄糖為主，當(dāng)葡萄糖耗竭后，乳酸會(huì)被細(xì)胞重新利用［8］。

半乳糖的替代流加也引起了CHO細(xì)胞氨代謝的變化。GF5的氨濃度從96 h開始快速累積，最終達(dá)到了12 mmol/L左右，GF4過程中氨的濃度從120 h開始同樣有明顯升高，終濃度也達(dá)到了10 mmol/L以上。與乳酸代謝類似，Con、GF1、GF2和GF3最終的氨濃度也都隨著培養(yǎng)過程的進(jìn)行而緩慢升高，最終達(dá)到了6 mmol/L左右（圖2-C）。

通過生化分析儀對(duì)各個(gè)培養(yǎng)過程的pH進(jìn)行離線檢測(cè)（圖2-D），從對(duì)應(yīng)過程的pH變化趨勢(shì)來看，GF4和GF5過程中pH值的升高很有可能與氨濃度的升高密切相關(guān)［9］。GF5的pH值從48 h開始快速上升，到120 h達(dá)到最高為7.8。同樣，GF4的pH值在96 h后開始快速升高，后期維持在7.6左右。而其他各組在整個(gè)培養(yǎng)過程中的pH均維持在6.7-7.0之間，在CHO細(xì)胞的正常耐受范圍內(nèi)。

因?yàn)镚F5的細(xì)胞較早地出現(xiàn)了死亡，因此只考察了其他過程的氨基酸代謝情況。圖3所示為244 h時(shí)培養(yǎng)液中各氨基酸的濃度情況。由圖可知，244 h時(shí)各過程下氨基酸的濃度基本一致，只有Glu、Gln和Ala三者顯示出了較大的區(qū)別。隨著半乳糖替代比例的增加，Glu的濃度不斷升高，其中GF5過程達(dá)到了2 146 μmol/L，是Con過程的1.7倍。同時(shí)，隨著半乳糖濃度的升高，胞外Gln的濃度逐步減少，其中GF5的最終濃度僅為112 μmol/L，幾乎消耗殆盡。結(jié)合各個(gè)過程中Gln和Glu的濃度趨勢(shì)以及氨代謝，說明在半乳糖替代比例較高的情況下，可能是葡萄糖代謝提供的能量有限，細(xì)胞轉(zhuǎn)向消耗Gln以提高能量供應(yīng)，因此其胞外的Gln濃度會(huì)隨著半乳糖替代比例的增加而逐步降低，而Gln的代謝產(chǎn)物Glu和氨會(huì)逐漸增加。此外，Ala濃度隨著半乳糖替代比例的增加而升高，這可能與乳酸代謝有關(guān)。

圖2 補(bǔ)料培養(yǎng)基中半乳糖替代對(duì)細(xì)胞代謝和pH的影響

2.1.3 半乳糖替代補(bǔ)料培養(yǎng)對(duì)Fc融合蛋白表達(dá)的影響 蛋白表達(dá)方面，在較低半乳糖替代范圍內(nèi)（0%-

圖3 補(bǔ)料培養(yǎng)基中半乳糖替代對(duì)氨基酸代謝的影響

40%），隨著半乳糖替代程度的增加蛋白表達(dá)量逐步增加，其中GF2最終達(dá)到了853 mg/L，是Con的1.21倍（圖4-A）。隨著替代比例的進(jìn)一步增加，F(xiàn)c融合蛋白的表達(dá)量反而逐漸下降，其中GF4僅為633 mg/L，是Con的85%，這可能是由于后期細(xì)胞的代謝出現(xiàn)更大的轉(zhuǎn)變，細(xì)胞維持能力變差引起的。

唾液酸是Fc融合蛋白最重要的質(zhì)量屬性之一，半乳糖的流加對(duì)其影響趨勢(shì)與其對(duì)蛋白表達(dá)量的影響十分一致（圖4-B）。同樣是在較低半乳糖替代比例（0-40%）內(nèi)，F(xiàn)c融合蛋白的唾液酸含量隨著半乳糖濃度的升高而升高，其中GF2達(dá)到了57.02 μg/mg，比對(duì)照組提高了30%左右。但進(jìn)一步增加半乳糖的替代比例，并沒有增加Fc融合蛋白的唾液酸含量，其中GF4過程反而比對(duì)照組減少了16%（圖4-B）。結(jié)合對(duì)應(yīng)過程的氨代謝及pH，很有可能是在更高半乳糖的替代情況下，氨的過量生成抑制了胞內(nèi)GDP-GNAc的合成，造成了Fc融合蛋白唾液酸合成前體的缺乏。

2.2 全部半乳糖替代對(duì)培養(yǎng)過程的影響

圖4 補(bǔ)料培養(yǎng)基中半乳糖替代對(duì)Fc融合蛋白表達(dá)的影響

為排除pH對(duì)培養(yǎng)過程的影響，在反應(yīng)器內(nèi)將pH控制在7.0左右，進(jìn)一步考察了全部半乳糖替代對(duì)細(xì)胞生長和產(chǎn)物唾液酸的影響。結(jié)果顯示，全部半乳糖替代的情況下，并未對(duì)細(xì)胞的生長造成不利影響，其最大活細(xì)胞密度甚至達(dá)到了1.41×107cells/mL（圖5-A），比搖瓶中的Con提高了40%，雖然其活細(xì)胞密度從192 h后開始明顯下降，最終僅為8.7×106cells/mL，但其細(xì)胞活性仍維持在99%左右。葡萄糖相對(duì)搖瓶內(nèi)更晚出現(xiàn)耗竭，第96小時(shí)葡萄糖濃度才跌至0 mmol/L（圖5-B）。從半乳糖的代謝趨勢(shì)來看，在0-192 h期間，細(xì)胞持續(xù)消耗半乳糖，其比消耗速率達(dá)到了0.54 mmol/（109cells·day），但是在192 h后，可能由于細(xì)胞狀態(tài)的改變，其并未進(jìn)一步消耗半乳糖。乳酸代謝可以分為3個(gè)階段，0-120 h內(nèi)乳酸持續(xù)生成，最高達(dá)到了27.5 mmol/L，其比成速率為1.96 mmol/（109cells·day）。隨后轉(zhuǎn)為消耗階段，比消耗速率為1.23 mmol/（109cells·day），當(dāng)培養(yǎng)到192 h時(shí)，乳酸濃度也跌至0 mmol/L。氨濃度相對(duì)于搖瓶過程有明顯減少，最終濃度為9.36 mmol/L。雖然全部半乳糖替代對(duì)細(xì)胞生長代謝沒有不利影響，但其產(chǎn)物的比生成速率僅為10.3 pg/（cell·day），比搖瓶中的對(duì)照組減少了50%（圖5-C）。同時(shí)，雖然將整個(gè)培養(yǎng)過程的pH控制在適合產(chǎn)物表達(dá)和唾液所修飾的范圍內(nèi)，但是和搖瓶的Con相比，最終產(chǎn)物的唾液酸含量仍然有所下降，僅為40.8 μg/mg（圖5-D）。以上結(jié)果說明，雖然在半乳糖全部替代的情況下，將pH控制在細(xì)胞的生理范圍內(nèi)，有效地降低了乳酸的生成，充分地支持了細(xì)胞的生長，但對(duì)于產(chǎn)物的表達(dá)和糖基化修飾會(huì)造成不利影響，可能是由于胞內(nèi)能量供應(yīng)不足引起的。

2.3 40%比例半乳糖替代對(duì)培養(yǎng)過程的影響

圖5 反應(yīng)器內(nèi)全部半乳糖替代對(duì)細(xì)胞生長和產(chǎn)物糖基化的影響

為了平衡細(xì)胞的代謝和糖基化的合成，進(jìn)一步在反應(yīng)器內(nèi)考察了40%比例半乳糖替代對(duì)培養(yǎng)過程的影響。將補(bǔ)料中40%比例的葡萄糖用半乳糖替代后，雖然最高活細(xì)胞密度較搖瓶內(nèi)更低一些，只有7.9×106cells/mL，但后期卻一直維持在6×106cells/mL以上，活性也在98%左右（圖6-A）。最終Fc融合蛋白的表達(dá)量達(dá)到了1 106 mg/L，比搖瓶的Con提高了43%。此外，培養(yǎng)過程中Fc融合蛋白的總唾液酸含量在168 h前呈上升趨勢(shì)，最高達(dá)到了71.2 μg/mg，隨后總唾液酸含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而下降，最終維持在60 μg/mg左右（圖6-B），但仍比搖瓶的Con提高了37%。對(duì)N-連接的糖基化分布檢測(cè)結(jié)果顯示，使用40%的半乳糖替代葡萄糖后，G0F（不帶半乳糖和唾液酸的糖型結(jié)構(gòu)）的含量從15.6%減少到了10.8%，而唾液酸含量則從35.6%提高到了42.2%，減少的G0F糖型都轉(zhuǎn)化為帶唾液酸化修飾的糖基結(jié)構(gòu)（圖6-C）。說明在Fc融合蛋白的表達(dá)過程中，半乳糖化修飾可能是限制蛋白唾液酸修飾的重要因素，因此半乳糖的加入可以有效地增加胞內(nèi)糖基前體的合成，提高了最終唾液酸的含量。

3 討論

作為CHO細(xì)胞重要的能源物質(zhì)，糖代謝在細(xì)胞的生長、代謝、蛋白的表達(dá)以及質(zhì)量等方面都發(fā)揮著重要的作用。本研究以一株表達(dá)Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞為對(duì)象，綜合考察了半乳糖替代流加對(duì)細(xì)胞生長、蛋白表達(dá)以及糖基化的影響。

細(xì)胞生長方面，在pH沒有控制的搖瓶中，60%比例以上的半乳糖替代條件下，細(xì)胞后期的活率出現(xiàn)了顯著的下降，這可能與過高的氨濃度直接有關(guān)［10］，也可能是由于過高的氨濃度引起了搖瓶內(nèi)pH的上升，進(jìn)而引起細(xì)胞的死亡［11］。在后續(xù)的反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)pH的穩(wěn)定控制，氨濃度得到了有效控制，細(xì)胞活率也得到有效維持，可見使用半乳糖替代葡萄糖的流加培養(yǎng)并不會(huì)對(duì)細(xì)胞生長造成不利影響。

圖6 反應(yīng)器內(nèi)40%替代半乳糖對(duì)細(xì)胞生長和產(chǎn)物糖基化的影響

代謝方面，60%以上半乳糖替代比例情況下，會(huì)出現(xiàn)葡萄糖耗竭的現(xiàn)象，細(xì)胞進(jìn)而轉(zhuǎn)向利用半乳糖和乳酸，因此GF4和GF5過程中的代謝副產(chǎn)物乳酸濃度有明顯的下降。60%替代比例的GF3過程雖然葡萄糖也控制在0 mmol/L左右，但是乳酸并沒有降低，和0-60%替代比例內(nèi)維持一致，說明葡萄糖和半乳糖的代謝相互關(guān)聯(lián)。糖酵解階段，氧化還原力平衡引起的ATP能力維持對(duì)于乳酸的代謝十分重要［12］，本研究中在60%以上半乳糖替代比例下，當(dāng)半乳糖提供的ATP的速率未能彌補(bǔ)葡萄糖濃度降低帶來的ATP損失時(shí)，乳酸開始明顯減少［13-14］。此外，結(jié)合TCA循環(huán)相關(guān)的氨基酸代謝，隨著半乳糖替代比例的增加，Glu的濃度不斷升高，胞外Gln的濃度則逐步減少。說明在半乳糖替代比例增大的情況下，可能是葡萄糖提供的能量代謝有限，細(xì)胞轉(zhuǎn)向消耗Gln以提高能量供應(yīng)，因此其胞外的Gln濃度會(huì)隨著半乳糖替代比例的增加而逐步降低，而其代謝產(chǎn)物Glu和氨會(huì)逐漸增加。

蛋白表達(dá)和糖基化方面，0-40%以內(nèi)半乳糖替代比例情況下，蛋白的表達(dá)量和總唾液酸含量都會(huì)隨著替代比例的增加而升高，而較高半乳糖替代范圍內(nèi)（60%-100%），兩者反而隨著替代比例的增加而有所減少。蛋白表達(dá)也與代謝緊密相連，較高替代范圍內(nèi)，基于TCA能量供應(yīng)有所減少，會(huì)進(jìn)一步降低線粒體的ATP勢(shì)能，從而造成產(chǎn)量的降低［15］。唾液酸方面，雖然更多半乳糖的加入可以增加唾液酸前體的合成，但是同時(shí)細(xì)胞有可能并不能對(duì)其進(jìn)行有效吸收。在全部添加半乳糖的情況下，半乳糖出現(xiàn)了大量的累積，在能量供給不充分的情況下，全部替代半乳糖的情況反而降低了唾液酸的含量，同時(shí)由于代謝的遷移，過多的氨的生成也會(huì)抑制糖基化的合成［10-11］。Gramer等［16］的研究結(jié)果表明適量的半乳糖添加可以有效增加抗體半乳糖化，Liu等［17］通過寡糖分析表明半乳糖化是融合蛋白唾液酸合成的限制步驟，20 mmol/L半乳糖使Fc融合蛋白的半乳糖化糖型和唾液酸化糖型比分別提高23.5%和20.3%，Lee等［18］添加 40 mmol/L半乳糖則使凝血因子Ⅱ的唾液酸含量提高了26%。因此在本研究中40%比例替代情況下，當(dāng)唾液酸前體的合成和能量供應(yīng)達(dá)到有效平衡，部分G0F糖型轉(zhuǎn)化為半乳糖型，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為帶唾液酸化修飾的糖基結(jié)構(gòu)，最終總唾液酸含量得到了有效提高。

4 結(jié)論

本研究以表達(dá)Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞為對(duì)象，通過補(bǔ)料培養(yǎng)基中用半乳糖替代葡萄糖的方式有效地提高了最終的蛋白表達(dá)量和總唾液酸含量，但機(jī)制仍值得進(jìn)一步研究，以利于建立高產(chǎn)高質(zhì)的培養(yǎng)過程。