乳酸菌在合成生物學中的研究現狀及展望

劉洋兒 郭明璋 杜若曦 賀曉云 黃昆侖 許文濤

（1. 中國農業(yè)大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100194；2. 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是指一類利用可發(fā)酵糖產生大量乳酸的菌群，通常為革蘭氏陽性菌，厭氧或兼性厭氧［1］，主要分布在乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、雙歧桿菌屬及片球菌屬等幾個屬中［2-3］。目前我國衛(wèi)生部已將34種微生物菌種列入《可食用菌種名單》，其中至少有28個菌種屬于乳酸菌，而可用于保健食品的11種益生菌菌種全部為乳酸菌。乳酸菌可以在泌尿、生殖系統(tǒng)中或黏膜部位黏附存活且無病原性［4］，可調節(jié)人體免疫能力，降低膽固醇、抗腫瘤，改善腸道菌群［5-6］。目前乳酸菌主要應用于食品工業(yè)生產中，在乳制品加工、果蔬發(fā)酵、釀造工業(yè)及肉制品生產領域應用廣泛［7］。據統(tǒng)計預測，我國乳酸益生菌類產品市場規(guī)模在2020年將接近850億元［8］。由此可見，我國乳酸菌產業(yè)發(fā)展蒸蒸日上，未來的機遇指日可待。

眾多實驗表明乳酸菌存在大量保健治療功能效果，可面向不同層面人群。例如，乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici）K15適用于免疫力低下人群，可增加唾液中的免疫球蛋白A（Immunoglobulin A，IgA），抑制病原體侵染宿主［9］；芽孢桿菌（Bacillus）益生菌適用于腸道炎癥人群，可清除腸道中金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），維持腸道菌群共生［10］；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）229v可改善重度抑郁癥患者的認知功能，提高其注意力與理解力［11］。但在乳酸菌研究過程中，存在篩菌技術繁復、周期長、成功率低等難點，特別是缺少穩(wěn)定繁殖特定功能乳酸菌菌株，這些都制約了乳酸菌在行業(yè)中的發(fā)展。因此，尋找行之有效的特定功能乳酸菌菌株開發(fā)方法成為了推動乳酸菌行業(yè)發(fā)展的一個重點。

合成生物學是一個新興的研究領域，它將分子生物學、工程學、數學、化學、信息學等學科知識與實踐結合在一起，為解決乳酸菌發(fā)展難題提供了一個新機遇。早在1980年，Hobom［12］和Bemer等［13］在描述轉基因細菌時就提出了“合成生物學”的概念，而今已被廣泛接受和應用。合成生物學可以將生物組件組裝集合，以生物電路的形式來產生預測效果［14］。目前，組件主要由DNA、RNA、蛋白質等分子組成，可在電路中互換位置。通過重組、整合與鑒定，創(chuàng)造出全新生物模塊、網絡、體系和生物體細胞。合成生物學在大量科研案例中已有重大突破，如藥物研發(fā)，生產胰島素挽救糖尿病患者的生命［15-16］；能源生產，使用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）有效地捕獲植物生物聚合物（如纖維素）中儲存的能量［17］；生物修復，設計微生物來修復一些最危險的環(huán)境污染物，包括重金屬和沙林等神經毒劑等［18］。乳酸菌作為當今研究熱點，應用合成生物學技術對其進行改造，按照人類需求進行相應表達，對開發(fā)乳酸菌菌株有很大意義。

本文將總結乳酸菌在合成生物學領域的突出優(yōu)勢、構建方法以及生產應用，根據大量實驗證實工程化乳酸菌的利用價值，為其后續(xù)研究進展、藥物開發(fā)等方面提供相應依據［19-22］。

1 工程化乳酸菌的優(yōu)勢及特點

合成生物學底盤即為可進行基因改造及組件引入的受體微生物細胞，可為細胞生長及組件工作提供各種組分，且足夠穩(wěn)定以便能在各個領域中應用［23］。目前大腸桿菌、銅綠假單胞菌等常被用作細胞底盤，其性能優(yōu)良，具有廣闊的設計空間、遺傳部位和調控元件，繁殖能力迅速且合成蛋白質穩(wěn)定，可高度適應實驗室條件［24］。但存在一些安全方面的擔憂：其一，這些細菌自身可能釋放內毒素，存在未知的隱患問題；其二，這些細菌基因工程操作過程中主要應用抗生素抗性基因作為選擇標記，具有轉移到環(huán)境微生物中的風險，而工程化乳酸菌在合成生物學中具有巨大的優(yōu)勢。

1.1 安全性

乳酸菌作為食品工業(yè)中安全系數較高的細菌，廣泛應用于食品工業(yè)制造中，諸多實驗證實其安全健康，不會產生致病物質［25］。在分子改造中，需要具備系統(tǒng)性基因編輯的工具，要求其達到食品級別，對人體無毒無害［26］。同時，一些乳酸菌載體具有在窄宿主范圍內進行復制的特點，例如來自卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）的316 kb大小的質粒載體，只能在它原始的宿主菌中才能復制；分離自羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）的載體pLUL631，其可在羅伊氏乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）與及其他受試的革蘭氏陽性菌中復制。這種特性使得細菌種間水平傳播發(fā)生的機會較少，更具安全性［27］。

1.2 革蘭氏陽性菌優(yōu)勢

目前合成生物學菌株的開發(fā)主要以革蘭氏陰性細菌為底盤細胞，其結構相對簡單，細胞壁薄易操作且基因組庫龐大。與革蘭氏陰性菌相比，革蘭氏陽性細菌的細胞壁較厚，可有效抑制機械損傷與滲透損傷，能否成功轉化是普遍關心的問題。在實際應用中，革蘭氏陰性菌的細胞壁結構不適用于全部合成生物學系統(tǒng)，但一些革蘭氏陽性菌卻在研究過程中發(fā)揮優(yōu)勢，如益生菌羅伊氏乳桿菌為革蘭氏陽性菌，其細胞壁可模仿金黃色葡萄球菌表征agr（accessory gene regulatory system）群體感應的方式，來檢測金黃色葡萄球菌產生的群體感應分子 自 誘 導 肽 -I（Autoinducer peptide-I，AIP-I）［20］。此外，乳酸菌不含有附著于細胞膜的脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）。LPS是革蘭氏陰性細菌外膜的組成部分，可導致細胞因子紊亂，從而引發(fā)心血管衰竭和血壓不穩(wěn)定，并最終導致致命性敗血癥綜合征［21］。人體攝入的乳酸菌，則不含有這種內毒素，從而避免過敏性休克［22］，可將乳酸菌廣泛用于疾病治療中。

1.3 食品發(fā)酵特殊性

大腸桿菌、銅綠假單胞菌等在環(huán)境修復、污水治理等方面有較大可行性，但不適宜用于食品和醫(yī)藥領域。乳酸菌多用于發(fā)酵以及釀造生產，除了可以提高營養(yǎng)價值外，還兼?zhèn)淞水a生乳酸、蛋白質、形成風味物質和產生抑菌物質等作用［28］?，F今國內外對乳酸菌的研究越來越深入，在食品生產中可利用合成生物技術對乳酸菌進行相應改造，投入到發(fā)酵、釀造工業(yè)中，進行定位定點發(fā)酵不易合成產物。例如，Rico等［29］構建了插入乳酸脫氫酶ldh基因的LAB菌株，通過非外消旋法發(fā)酵L-乳酸，用作制藥與食品生產，生產效率極高。就目前乳酸菌研究現狀來看，可在其底盤上插入對抗腸胃疾病、糖尿病等疾病的特定基因，利用乳酸菌發(fā)酵原理，將藥物性能體現在乳制品中，方便高效，同時增強口感，為食品與藥物發(fā)展提供新思想。

1.4 腸道內定植性

乳酸菌可以在宿主體內進行定植。其發(fā)揮作用的前提是可以到達腸道后進行黏附，與宿主腸上皮細胞牢固結合，避免其被胃酸、膽汁等胃腸道分泌的液體和腸道的蠕動所清除。而后乳酸菌充分適應腸道環(huán)境，進行繁殖，在黏附膜表面形成微生物膜，防止外來菌入侵，保護腸黏膜的健康。Russo等［30］使用斑馬魚模型研究了乳酸益生菌在體內定植能力。利用植物乳桿菌Lp90，植物乳桿菌B2和發(fā)酵乳桿菌PBCC11.5中的pRCR12質粒進行熒光標記，從而監(jiān)測乳酸菌的黏附定能力結果發(fā)現，乳酸菌可快速定植且植物乳桿菌菌株表現出更強的黏附能力。Prado-Rebolledo等［31］研究了乳酸菌對肉雞腸道沙門氏菌腸炎沙門氏菌腸道定植和腸道通透性的影響，將食用乳酸菌與腸炎沙門氏菌肉雞組和食用對照與腸炎沙門氏菌肉雞組進行比較，觀察到盲腸中腸炎沙門氏菌數量的減少，且在實驗的72 h周期內，乳酸菌可穩(wěn)定定植。乳酸菌在腸道內進行穩(wěn)定快速定植對其益生作用具有很大的意義。

2 乳酸菌合成生物學發(fā)展進程

乳酸菌的應用歷史十分久遠，但人類能夠科學地研究并利用乳酸菌卻始于19世紀中葉。而對于乳酸菌合成生物學研究而言，在30多年發(fā)展期間有著重大突破。

2.1 乳酸菌基因敲除階段

20世紀末期，隨著分子生物學逐漸發(fā)展，人們更加清晰地了解了乳酸菌在遺傳基因水平的代謝規(guī)律。早期人們運用基因敲除技術研究乳酸菌功能作用。例如，Ferain等［32］將兩個ldh基因敲除掉，研究其對植物乳桿菌中肽聚糖前體合成的影響。2001年，Bolotin等［33］完成了對乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403的測序。這是對于乳酸菌的第一例測序，在這個過程中發(fā)現乳酸菌基因組中存在某些非必需基因，如次級代謝物基因簇、冗余序列等［34］。在這個過程中發(fā)現可將非必需基因敲除掉，促進乳酸菌基因組的簡化，同時基因敲除技術可提高乳球菌染色體在遺傳分析中作用的成功率［35］，使得乳酸菌更容易適應豐富的營養(yǎng)環(huán)境［36］。在這一時期，乳酸菌基因改造中研究最多的為篩選標記基因，如紅霉素［37］、氯霉素［38］等標記基因，這對鑒別受體細胞中是否含有目的基因起到識別與篩選作用。而經過基因改造過的細菌，在1987年Flickinger等［39］首次報道的乳酸菌電轉化方法中，可成功轉化到乳酸菌底盤中。這些研究為乳酸菌基因工程的發(fā)展奠定了堅實的基礎。

2.2 工程化乳酸菌階段

隨著轉基因技術發(fā)展熱潮，對乳酸菌的研究較多為乳酸菌基因工程技術或工程化乳酸菌技術。在這一時期，乳酸菌載體構建及應用成為該領域研究的前沿和熱點。乳酸菌重組需要用到特定的重組基因載體質粒，將相應片段進行酶切，同時連接上目的基因片段，在質粒上進行基因改造。乳酸菌重組技術具有周期短、代謝快等特點。在這個過程中，其對于食品工業(yè)發(fā)展有重要作用，如高效過量產生胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS），可改善酸奶品質［40］；乳球菌菌株代替添加α-酮戊二酸來改善奶酪的香氣［41］；增加肽酶活性，可縮短干酪成熟期，生產具有改善特性的特殊奶酪［42］。同時也發(fā)現，電轉化成功率存在弊端，Rattanachaikunsopon團隊［43］研究了一種利用玻璃珠震蕩產生能量的方法進行轉化，使其轉化效率大大提高。這一時期為向合成生物學轉化的過渡時期，重組乳酸菌的研究在逐漸向應用方面發(fā)展。

2.3 乳酸菌合成生物學階段

發(fā)展至今，乳酸菌合成生物學逐漸替代傳統(tǒng)改造基因的概念，不僅能夠優(yōu)化乳酸菌菌種，構建遺傳密碼，提高對底物和能量的利用效率，同時也可以利用宿主體內自身代謝機制，通過外源物質刺激進行宿主自身調控。在這個階段乳酸菌可以使用不同表達系統(tǒng)的載體質粒，還可對其進行優(yōu)化，強啟動子［44］的鑒別與篩選使得質?？筛咝П磉_，提高其對外界環(huán)境的抗干擾性。除對表達元件進行了優(yōu)化，載體構建開始考慮在食品生產應用中易存在的缺陷，食品級乳酸菌表達載體的構建得到研究者的重視［45-46］。這個過程中，醫(yī)學與生物學方面得到乳酸菌合成生物學技術的支持，例如乳酸菌分泌胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-likepeptide1，GLP-1）使大鼠的血糖明顯下降［47］；重組乳酸乳球菌 NZ9000預防高血糖癥［48］等（圖1）。因此21世紀初期，研究人員致力于通過對乳酸菌基因組學的研究及基因工程技術的應用，改良現有的乳酸菌菌種，從而選育出集多種優(yōu)勢基因的對社會帶來更大效益的乳酸菌新菌種。

3 乳酸菌合成構建的方法

對于一個生物系統(tǒng)來說，層次化的結構是構成整體的本質。具有一定功能的DNA序列可組成最簡單基因表達元件（Part）；不同功能的基因表達元件按照一定的邏輯和物理順序連接組成復雜的生物裝置（Decice）；而不同功能的生物裝置協(xié)同運作組成更加復雜的生物系統(tǒng)（System），含有多種不同功能系統(tǒng)的生物體彼此通訊互相協(xié)調組成更復雜的多細胞或細胞群體生物系統(tǒng)。因此，工程化乳酸菌表達元件的設計、載體的選擇，以及最終的轉化、整合變得十分重要。

3.1 表達元件設計

合成生物學的特點即為簡便性和標準化，通過建立標準化的生物元件，形成規(guī)模體系，從而完成構建過程，達到生物合成的目的［49］。在設計細菌表達載體時，需要具備幾個結構元件，如啟動子（Promoter）、核糖體結合位點（Ribosome binding site）、終止子（Terminator）、操縱子（Operon）等調控元件，同時需要質粒載體骨架序列及蛋白質結構域等，實現基因電路的表達。

現如今已經從乳酸菌中分離出大量不同強度的組成型啟動子和終止子在菌種中進行表達。植物乳桿菌可在工業(yè)、醫(yī)學及生物技術領域中表達重組蛋白，而表達水平的控制關鍵取決于啟動子強度、基因拷貝及翻譯效率。Tauer等［44］從植物乳桿菌033和布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）034中分離出強啟動子（如轉錄延伸因子啟動子），在植物乳桿菌033中都可用于表達蛋白質，且在同等條件下，高拷貝數的復制起點使表達量增加了兩倍。同時使用誘變啟動子的方法，可以使乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和植物乳桿菌產生更加龐大的組成型啟動子文庫。

3.2 載體的選擇

要形成一個完整的系統(tǒng)，就需要載體來承載各種元件。載體是指按照人類意愿有目的地進行改造，攜帶外源基因，可創(chuàng)建生物遺傳性的運載工具。這種運載工具需要具備自主復制能力，且有高效存活率，方便操作，易于識別等特點。乳酸菌作為廣泛作用的益生菌，其表達載體主要可分為非食品級乳酸菌表達載體和食品級乳酸菌表達載體兩類［45-46，50］。為了達到篩選特定菌株的目的，通常會將具有抗性篩選標記的基因連接在載體上，得到相應特定菌株［51］。這樣的載體通常為非食品級乳酸菌表達載體，其中常見的抗性篩選基因為紅霉素及氯霉素等基因，易轉移到環(huán)境與內源微生物中。

圖1 乳酸菌合成生物學發(fā)展進程

在食品工業(yè)生產中，為了避免因食品安全引發(fā)的問題，載體必須為食品級乳酸菌表達載體，遺傳特性清楚，且能穩(wěn)定遺傳，可為人類食用。近幾年人們就食品工業(yè)生產的應用來研究乳酸菌食品級載體，將食品級選擇標記基因轉入載體中。例如，以乳酸乳球菌 NZ3900為宿主菌的食品級乳酸菌表達載體 pNZ8149［45］，大小為 2.5 kb，在NcoⅠ位點后攜帶有Nisin誘導的啟動子PnisA，并含有l(wèi)acF基因，而它則以乳糖作為選擇標記，通過乳糖物質進行篩選。Takala等［46］構建的乳酸菌食品級質粒pLEB590，主要由pSH71復制子，抗性nisI基因和用于nisI表達的組成型啟動子P45組成。之后將質粒pLEB590成功電轉乳酸乳球菌和植物乳桿菌中，發(fā)現pLEB590這一食品級別載體在兩種底盤中都可以進行成功表達。這些研究表明，食品級選擇標記基因已進行了大量研究，將其插入載體上可得到安全系數較高的乳酸菌，可滿足人類對食品生產的要求，同時便于識別篩選，簡化合成生物學的操作。

3.3 轉化方法

在合成生物學中，當載體上插入相應啟動子、報告基因、核糖體結合位點及終止子等元件后，要想使其進行相應表達，則需要通過轉化將載體DNA導入到細菌底盤中。這一步是使得宿主細胞含有目的基因最關鍵的一步。合成生物學中最常用的大腸桿菌在進行轉化時通常使用熱激法。但由于乳酸菌有較厚的細胞壁，可阻礙DNA分子進入細菌，普通熱激法無法有效地使外源DNA進入受體細胞，因此尋找行之有效的方法變得尤為重要。

目前報道的乳酸菌轉化方法主要有3種，原生質體轉化法、電轉化法以及玻璃珠轉化法。前者操作復雜且轉化率低，無法在工業(yè)化生產中得到廣泛使用。1987年，Flickinger等［39］首次報道了對干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）的電轉化，這是一次值得鼓舞的進步。然而乳酸菌電轉化方法容易受到諸多因素的影響，例如細胞弱化劑的種類及濃度、細胞的生長狀態(tài)、電擊條件、質粒濃度、質粒本身構建條件等。目前已有的研究多是在細胞弱化劑、細胞生長狀態(tài)、電擊條件等方面進行優(yōu)化與完善。如賈士芳等［52］對嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）JL-1的電轉化條件進行了研究，指出使用氨芐青霉素處理轉化受體能有效提高轉化效率，而使用甘氨酸處理則無顯著影響。

雖然電轉化法被認為是一種流行的乳酸菌轉化方法，但其設備昂貴、轉化效率低。玻璃珠轉化法是在DNA和聚乙二醇存在下，將細菌原生質體與玻璃珠進行攪拌，使得載體轉入細菌底盤中。Rattanachaikunsopon等［43］通過使用革蘭氏陽性細菌作為pGK12的受體進行玻璃珠轉化（pGK12是攜帶紅霉素抗性基因的4.4 kb大腸桿菌/乳球菌穿梭載體），將其成功轉化到糞腸球菌TISTR 927、干酪乳桿菌ATCC 393、乳酸乳球菌DSM 20481、葡聚糖鏈球菌ATCC 19255、無害李斯特菌DSM 20649、金黃色葡萄球菌ATCC 25923和肺炎鏈球菌ATCC 10015中。之后，該團隊再次利用pGK12質粒，運用玻璃珠轉化法將其成功轉化到葡聚糖明串珠菌ATCC 19255乳酸菌菌株中［53］。這一發(fā)現，使得乳酸菌轉化提高了重復性與效率，通過不斷優(yōu)化與改進，可將其運用到工業(yè)生產中。

3.4 基因編輯技術

目前，基因編輯技術逐步成為合成生物學主要技術之一?；蚓庉嬍侵笇δ康幕蜻M行插入、敲除或替換等方式，來滿足人類特定需要的技術。

3.4.1 同源重組 早在20世紀80年代，發(fā)展起一種新型分子生物學技術手段，即為基于同源重組的基因敲除技術。同源重組依賴于基因同源序列的聯(lián)會，DNA分子間或者分子內交換對等的部分，發(fā)生重新組合。運用這種技術，可將乳酸菌的代謝流向發(fā)生改變，食品工業(yè)生產中能有效降低發(fā)酵成本，提高產物的生產水平及純度。乳酸鏈球菌（Streptococcus Lactis）712的乳糖質粒容易發(fā)生缺失現象，對于外源基因轉化進入菌株中的方法來說，存在弊端，因此將乳酸鏈球菌712、乳酸鏈球菌C2和乳脂鏈球菌（Streptococcus cremoris）C3乳糖質粒的乳糖和蛋白酶基因進行轉導，從而插入染色體中，構建擴大的乳糖質粒［54］。Leenhouts等［35］則進行同源重組單交換雙交換進行基因敲除，并將其稱之為Campbell型整合，在乳酸乳球菌中對Campbell型質粒進行基因敲除，可提高乳球菌在遺傳分析中的染色體改造成功率，同時有助于穩(wěn)定乳球菌中的不穩(wěn)定基因。

3.4.2 單鏈DNA（ssDNA）重組工程 同源重組技術雖然得到廣泛的應用，但是其中的工具大多用于單基因操作，而在基因組突變中，如通路工程和基因電路工程突變中，則需要額外的工具［55］。一些運用于工業(yè)與醫(yī)學的細菌菌株，需要高效且精準的進行編輯基因組來及時改善，增強效果。在各種乳酸菌中，可以通過ssDNA重組工程在染色體中產生突變來實現［56］。ssDNA重組工程是一種在細菌染色體上進行細微變化的技術，其中表達單鏈DNA結合蛋白（RecT或Bet）的細胞是通過寡核苷酸進行轉化，而該寡核苷酸主要通過退火和復制進行結合。Van Pijkeren等［57］首先鑒定了乳桿菌屬和乳酸乳球菌屬中的ssDNA結合蛋白同源物，之后為了評估能否進一步提高羅伊氏乳桿菌ATCC PTA 6475的重組工作效率，就在該菌株中表達了幾種RecT同源物。其中來自糞腸球菌（Enterococcus faecalis）19的RecT與天然RecT蛋白相比產生相當的效率，但是其他蛋白沒有提高重組率。因此他們通過增加寡核苷酸濃度以及使用含有硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸，成功地將乳酸乳球菌的重組工作效率提高了10倍。該研究表明通過ssDNA重組工程對乳酸菌進行定向遺傳修飾可以簡化菌株改良的步驟，提高其工作效率及成功率。

同時研究發(fā)現，ssDNA重組工程可誘導噬菌體衍生 ssDNA 結合蛋白（RecT或 β）的表達［58-60］。當寡核苷酸存在于細胞中，ssDNA可結合蛋白對寡核苷酸進行保護作用，避免其被宿主核酸酶降解，有助于寡核苷酸與模板DNA形成復合物［61-62］。這對于基因編輯技術而言，又得到了進一步的提升。

3.4.3 ssDNA重組工程結合CRISPR-Cas9技術 在新物種中建立ssDNA重組工作并非易事。例如，在沒有選擇的情況下可以產生突變的菌株很少。目前研究更多是將ssDNA重組工程與CRISPR-Cas9技術相結合，可極大程度上提高突變效率。例如，羅伊氏乳桿菌ssDNA結合蛋白（RecT）可通過寡核苷酸與DNA復制叉滯后鏈雜交的方式來促進誘變，而Cas9核酸酶靶向野生型基因序列進行消除，從而富集突變等位基因［63］。此外，CRISPR-Cas9系統(tǒng)也可以與同源重組等基因改造技術相結合，提高基因敲除或基因編輯的效率。

4 乳酸菌合成生物學的應用

隨著合成生物學的發(fā)展，乳酸菌作為載體傳遞系統(tǒng)，在醫(yī)療、生物等領域有廣泛應用，同時可利用乳酸菌產生乳酸這一特性，發(fā)揮其在發(fā)酵、釀造等食品生產方面作用，為食品行業(yè)帶來新的機遇。此外，在乳酸菌研究過程中，融入了人與自然概念，使其在環(huán)境治理、修復方面擁有重大突破，因此對其進行合成生物學技術改造，可使其在自然科學方面繼續(xù)發(fā)揮作用。

4.1 傳感器

近年來，合成生物學廣泛用來設計各種微生物，這種重組微生物具有治療疾病、抑制癌癥和治療病原體等能力，主要作為載體運送藥物。然而合成生物學最重要的一點是可以響應細菌群體感應分子，從而進行自身調控。在以前的研究中，微生物已被設計用于響應來自革蘭氏陰性病原體的群體感應分子，例如銅綠假單胞菌，而關于使用革蘭氏陽性菌微生物來感知群體感應的研究很少。Borrero等［64］在乳酸乳球菌中構建pCF10載體，其中插入腸球菌素A，和腸球菌素P等基因，產生并分泌抗性肽，可特異性靶向檢測腸球菌且抑制多藥抗性屎腸球菌菌株的生長。而David等［20］構建工程化羅伊氏乳桿菌調控系統(tǒng)，其設計組成型啟動子slp，可表達agrC，agrA；組成型啟動子P3可持續(xù)表達β-葡糖醛酸糖苷酶，這種酶可跨膜到細菌體外，使4-硝基苯基-β-D-葡糖苷酸轉化成黃色色素，從而進行測定金黃色葡萄球菌產生的群體感應分子自誘導肽-I（AIP-I）。

利用乳酸菌合成生物學作為傳感器檢測濃度范圍廣，對低濃度物質十分靈敏，同時在檢測過程中省時省力，避免大型儀器測樣的繁雜程序，這對于疾病的診斷及定量測定具有極大意義。

4.2 疾病治療

由于生活節(jié)奏加快，導致腸胃炎癥、肥胖、糖尿病等疾病已成為當今社會流行性疾病。普通治療方法如藥物治療、手術治療等存在花費高、風險大等隱患，存在一定副作用。乳酸菌合成生物學的發(fā)展為疾病治療及藥物傳遞提供了可能性［65］。

早在20世紀末，乳酸菌合成生物學在醫(yī)療方面已經創(chuàng)造了新方向，其利用重組乳酸菌進行基因改造，作為運輸載體進入體內后，可以表達對應疫苗，使機體產生抵抗感染的免疫反應，以達到預防疾病的目的，如Robinson等［66］設計重組乳酸乳球菌MG1363表達破傷風毒素，可進行治療破傷風。而Steidler團隊［67］則對治療結腸炎進行研究，利用乳酸乳球菌分泌白細胞介素-10治療小鼠結腸炎。而后Xin團隊［68］對于口服輸送疫苗有了新發(fā)現，通過用表達HIV Env的痘苗病毒攻擊小鼠腹膜，發(fā)現此組小鼠病毒載量比對照小鼠低350倍，證明該策略對HIV免疫應答過程中具有抑制功效。這些實驗證明乳酸菌合成生物學在醫(yī)療方面發(fā)揮了突出作用，將口服作為另外一種運輸途徑，可進行與傳統(tǒng)穿刺方式不同的免疫作用，使得疫苗具有穩(wěn)定代謝途徑。

利用乳酸菌合成生物學進行治療疾病是一個循序漸進的過程。在之后研究過程中，治療炎癥性腸病成為研究重點。這種由胃腸道炎癥引起的特發(fā)性疾病，會引起急性或慢性腹痛、血性腹瀉、體重減輕、發(fā)燒、疲勞和食欲不振等現象［69］。目前針對炎癥性腸病的治療方法仍未確定，通常是對癥治療，旨在維持患者無癥狀。超氧化物歧化酶（SODs）可將超氧陰離子轉化為過氧化氫（H2O2），其被認為是抵抗氧化應激的主要防御措施。然而，在炎癥性腸病治療中由于SOD短循環(huán)半衰期僅5至10 min，治療過程中易受到阻礙，因此Han團隊［70］設計了pNZ804sodA質粒，其可由nisA啟動子控制，表達sodA基因從而獲得MnSOD，之后將該質粒轉化到乳酸乳球菌NZ9800和植物乳桿菌NCIMB8826 Int-1菌株上，發(fā)現炎癥性腸病大鼠癥癥狀減輕。而Pang團隊［71］通過給予口服分泌抗TNF納米抗體的乳酸乳球菌，在慢性結腸炎中顯示出治療功效；Motta等［72］設計表達Elafin的重組乳酸菌可防止炎癥并恢復結腸穩(wěn)態(tài)。將這種重組乳酸菌作為載體，其在腸道內可進行定植，安全高效，在人體內能夠長時間表達，這對作用于胃腸黏膜進行治療炎癥有突出貢獻。

工程化乳酸菌同時存在治療糖尿病的潛力。糖尿病主要分為1型糖尿病與2型糖尿病，其可通過免疫功能紊亂、微生物感染等致病因子致使機體胰島功能減退，造成代謝紊亂。其中1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，可逐漸破壞產生胰島素的β細胞。Ma團隊［48］構建的質粒，即乳酸乳球菌菌株NZ9000工程化表達HSP65-6P277，調控β細胞分泌胰島素，改善葡萄糖耐量，減少胰島炎。而胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）是一種腸降血糖素，同樣能夠增強胰島素分泌，成為治療2型糖尿病主要治療劑。Agarwal等［47］構建了LL-pUBGLP-1質粒，其上插入GLP-1基因片段，可分泌胰高血糖素樣肽-1，使得大鼠的血糖明顯下降，可預防高血糖癥。傳統(tǒng)口服降血糖藥物容易產生過敏現象，產生耐藥性，同時會對肝臟系統(tǒng)造成損傷，而重組乳酸菌進入胃腸道后，可進行表達相應肽，進行定點輸送，提高機體自身免疫功能，這對于治療糖尿病開辟了新的道路。

而在社會發(fā)展過程中，癌癥作為三大致死疾病之一，其發(fā)病率不斷上升，同時根據以往實驗觀察，發(fā)現其與慢性炎癥息息相關。在這個過程中，乳酸菌介入治療的方法被不斷深入研究。目前已經從乳酸菌菌體細胞［73］、細胞質成分［74］等多方面證實乳酸菌存在抗癌作用。面對此現象，將乳酸菌進行合成生物學改造十分有必要，主要還是存在缺少特異性菌株、篩選繁復等問題。若將現有研究抗癌相關機理研究透徹，利用分子生物學技術、基因工程等手段對DNA進行改造，乳酸菌菌株可實現利用最大化，對醫(yī)學進展也是一個極大的突破。

4.3 食品工業(yè)

乳酸菌作為重要的食品微生物，可在食品生產中廣泛應用，如酸奶發(fā)酵、干酪成熟、生產乳酸等。如今消費者對乳制品的產品質量要求較高，而提高質量的方法通常通過增加脂肪、糖、蛋白質或穩(wěn)定劑（如果膠，淀粉，藻酸鹽或明膠）的含量來實現。然而調查中發(fā)現，人類對于營養(yǎng)與健康有了新的見解，尋找更加高效、低脂肪、低糖、低添加劑方法成為乳制品的一個新挑戰(zhàn)。

胞外多糖是乳酸菌生長代謝過程中分泌的一種糖類化合物，可改善發(fā)酵乳制品（例如酸奶）的流變性、質地和口感，但其存在產量低，菌株穩(wěn)定性差的缺點［75-76］。Felipe等［40］發(fā)現，質粒 pNZ8020插入nox-2基因，由內源性nisA啟動子控制可實現NADH氧化酶的過量產生，從而產生過量胞外多糖。這些發(fā)現為工業(yè)化生產胞外多糖提供了便利條件。

干酪作為乳制品中的代表食品，對其品質的研究不在少數。為增加干酪風味，可通過質粒自我復制后，在乳酸菌中過表達肽酶基因實現干酪成熟。將pepN、pepC、pepX、pepI表達肽酶基因結合到瑞士乳桿菌pFG1中，該食品級載體轉入乳酸乳球菌DN209和NM1后，發(fā)現工程化乳酸乳球菌與野生型乳酸乳球菌相比，可以增加肽酶活性，縮短干酪成熟期，生產具有改善特性的特殊奶酪（如減脂奶酪）［42］。此外，氨基酸的酶促降解在風味干酪的開發(fā)中起重要作用。編碼谷氨酸脫氫酶的解淀粉芽孢桿菌的gdh基因可轉入乳酸乳球菌中進行表達，使得谷氨酸高效表達，從而產生大量α-酮戊二酸［41］。實驗證明可以使用產生GDH的乳球菌菌株代替添加α-酮戊二酸來改善奶酪的香氣。

對于乳酸菌發(fā)酵而言，乳酸是碳水化合物快速轉化后易得產物。乳酸主要可分為D-乳酸和L-乳酸。其中D-乳酸不被人代謝，而L-乳酸是食品生物技術應用中最重要的異構體，也是制藥和生物聚合物工業(yè)中最重要的異構體。因此需要尋找特定方法進行定向高效生產L-乳酸。除使用合理的代謝工程方法之外，還可通過遞歸原生質體融合的經典菌株改良方法（亞硝基胍和紫外誘變）與全基因組改組相結合，增強乳酸的產生。這種方式可分離乳桿菌工業(yè)菌株的改組菌株，使其在pH4.0條件下產生比野生型多三倍的乳酸［77］。對于益生菌乳桿菌來說，可通過遺傳操作，增強乳酸菌菌株的健康屬性、開發(fā)新的益生菌活性，同時可深層次理解潛在分子機制。

4.4 生物再生能源

由于環(huán)境問題日益嚴峻，能源可持續(xù)發(fā)展成為日益關注的問題［78-79］。近年來，利用微生物大規(guī)模生產可再生生物燃料引起了人們的極大關注，主要是由于石油燃料逐漸短缺引起的，且石油基燃料過度使用產生有害氣體，嚴重污染了環(huán)境，導致全球氣候變暖等諸多生態(tài)問題。因此代謝工程與乳酸菌合成生物學發(fā)展可以使非天然生物燃料生產清潔生物燃料。

面對石油能源不可再生問題，醇作為可燃能源已得到大力支持。丁醇已成為公認的優(yōu)質生物燃料，其比乙醇蓄積能量豐富，并且可以直接用作投入燃料，無需改變發(fā)動機［80］。傳統(tǒng)的生物燃料用糧食作物生產［81］，如今丁醇可以通過革蘭氏陽性梭菌屬物種發(fā)酵底物來生產。然而，為了在工業(yè)規(guī)模上有利地生產丁醇，需要具有增加丁醇耐受性的新型微生物來提高效率。Liu等［82］通過對丁醇微生物分離與選擇，發(fā)現卷曲乳酸桿菌 NE-L 0206-47和融合乳桿菌（Weissella confusa）BR0216-18能夠在3%-4%丁醇中長期適應生長。同時木質纖維素生物質是世界上最豐富的底物類型，經濟節(jié)約且可再生，但是使用微生物將木質纖維素原料轉化為第二代能源產品尚未在商業(yè)上大規(guī)模使用，因此需要進行大量篩選實驗，以確定菌株對來自木質纖維素生物質預處理的各種抑制劑的耐受性水平，以及它們利用各種糖底物（包括戊糖和己糖）的能力。這些實驗證實乳酸菌的發(fā)酵能力在生產生物能源方面得到肯定，同時可以作為催化劑進行工業(yè)加工。

乳酸菌可進行生產生物燃料，但是其生產率仍然非常低，并且包括耐受性等因素需要進一步改進。乳酸菌本身可在酸性條件下進行存活與作用，醇存在時也可進行相應代謝，但當pH值過低、溫度變化大、醇醛等物質含量過高條件下，乳酸菌生物活性受到抑制，這些因素可稱為毒殺乳酸菌的外界因子，因此合成生物學技術的出現可以應對這種缺陷。在載體質粒上插入抗酸、抗醇等基因片段，對密碼子進行優(yōu)化，啟用高拷貝數啟動子等應對措施，這些因素都可在今后實驗研究中得到逐步證實。

5 展望

乳酸菌合成生物學作為新興的研究學科，起步較晚，但研究頗豐，越來越受到科研人員的重視。它將科學與工程結合在一起，融匯多種領域的內容，將DNA、RNA、蛋白質等分子結合，創(chuàng)造出全新體系，從而滿足人類需求。面對大眾對于基因工程擔憂，乳酸菌作為食品級別細菌在自然界分布廣泛，可用于食品加工，對食品安全有保障，并且一些乳酸菌對人體健康有促進作用，因此對乳酸菌進行工程化設計，可緩解人類對于重組細菌的憂慮。目前乳酸菌合成生物學在大量的科研案例中有重大突破，可生產藥物、促進食品工業(yè)生產、環(huán)境修復以及降解污染物等。

乳酸菌合成生物學與基因工程同時需要構建載體，表達目的基因，但其最大的區(qū)別在于合成生物學翻譯蛋白同時，要充分調動宿主自身代謝機制，做到外源物質刺激狀況下，可以進行群體感應，實現自身調控撲殺。當外源物質不存在時，其乳酸菌底盤可穩(wěn)定定植于宿主腸道體內，進行普通發(fā)酵作用促進腸道健康?，F如今乳酸菌合成生物學在應用中仍存在一些缺陷，表達載體構建中，表達元件的優(yōu)化依舊需要持續(xù)研究。同時載體轉化依舊需要尋找更加高效轉化方法，形成系統(tǒng)性、成功效率高的方法體系。

盡管目前取得了一定進展，但乳酸菌在合成生物學方面的臨床應用仍有很長的路要走。利用現有的工具和發(fā)展速度，很容易實現合成生物學對于藥物發(fā)現、藥物開發(fā)以及其他方面進展有巨大貢獻。對于工程化乳酸菌的研究一直在持續(xù)，期待工程化乳酸菌在科研方向的其他突破。