張競(jìng)超 張偉晶 周曉娜

【摘 要】目的：探討異氟烷預(yù)處理對(duì)大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制與磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（PI3-K/AKT）信號(hào)通路的相關(guān)性。方法：將36只SD雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：假手術(shù)組、模型組及異氟烷組。采用線栓法制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型，缺血2h再灌注24h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。氯化三苯基四氮唑（TTC）染色檢測(cè)腦梗死面積，免疫組化法檢測(cè)PI3-K、p-AKT表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，異氟烷組神經(jīng)功能缺損程度明顯減輕，腦梗死體積明顯減少，PI3-K、p-AKT陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：異氟烷通過(guò)激活PI3-K/AKT信號(hào)通路，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能是其對(duì)腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】異氟烷；腦缺血再灌注；PI3-K、AKT

【中圖分類號(hào)】R79 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1005-0019（2019）15-0-01

越來(lái)越多的研究證實(shí)可吸入麻醉劑的預(yù)處理能降低缺血再灌注損傷，在一定程度上修復(fù)神經(jīng)功能，但目前異氟烷預(yù)處理的腦保護(hù)機(jī)制尚不明確[1]。異氟烷（ isoflurance，ISO） 是臨床常用的揮發(fā)性麻醉劑，可誘導(dǎo)新生鼠和成年鼠腦的預(yù)處理效果[4]。ISO 的預(yù)處理在圍手術(shù)期可降低腦卒中的發(fā)生率，在確保麻醉效果的同時(shí)最低程度影響患者腦功能。該研究通過(guò)大鼠動(dòng)物模型神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死面積測(cè)定以及PI3-K/AKT的表達(dá)率，初步揭示ISO 腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康的成年雄性 SD 大鼠共 36只，重約 250～280 g。依照隨機(jī)分組原則將其分成分為假手術(shù)組、模型組及異氟烷組，每一組分別包括 12只大鼠。大鼠在進(jìn)行神經(jīng)缺損評(píng)分后，每組動(dòng)物中再次按隨機(jī)原則選出 6只進(jìn)行腦切片的TTC染色，余下6只行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2 揮發(fā)性麻醉藥預(yù)處理

首先將麻醉機(jī)回路和大鼠麻醉箱進(jìn)/出氣口連接，然后以5L/min氧流量流經(jīng)異氟烷蒸發(fā)罐，蒸發(fā)罐開(kāi)啟濃度為3%，含麻醉藥氣體流經(jīng)麻醉箱，出氣口連接Solar8000M型麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀，待箱內(nèi)異氟烷濃度達(dá)1.0MAC，且穩(wěn)定10min后將大鼠置入，持續(xù)吸入麻醉20min后待大鼠肺內(nèi)麻醉藥濃度和箱內(nèi)平衡后，迅速?gòu)南鋬?nèi)取出大鼠并將其口鼻部置于相同濃度的大鼠面罩內(nèi)維持麻醉。

1.3 TTC 染色步驟：

深度麻醉大鼠，經(jīng)心臟灌注 PB（100mL），斷頭取腦，將腦 組織在 4℃的生理鹽水中冰凍 5min 后，由前極向后沿冠狀面切 2mm 切片，將切片置于2%TTC 的 0.2PBS 中，PH：7.4，37℃避光孵育 30min，每間隔 5nin 輕柔晃動(dòng)平皿，然后將 TTC 液倒出，在 PBS 中洗三次，每次 1min，最后在 4%的多聚甲醛中固定，相機(jī)拍照。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分

使用 Zea-longa 5 分制法，對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀行量化評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)： 0 分，未觀察到神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)； 1 分，手術(shù)對(duì)側(cè)前腿不能完全伸直； 2分，爬行路徑中向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈； 3 分，爬行過(guò)程中向手術(shù)對(duì)側(cè)歪倒； 4 分，未觀察到有自發(fā)行走，伴或不伴意識(shí)障礙； 5分，死亡。評(píng)分為 1～3 分且無(wú)蛛網(wǎng)膜下腔出血者被視作模型制作成功，納入實(shí)驗(yàn)。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

腦片經(jīng)脫蠟、脫水，PBS 液漂洗，進(jìn)行抗原修復(fù)，雙氧水封閉，山羊血清封閉，后加入一抗，4 ℃ 孵育過(guò)夜； 次日，室溫復(fù)溫 30 min，移去一抗，PBS 液漂洗，滴加二抗（ 山羊抗兔 Ig G） ，置于 37 ℃ 溫浴箱中 20 min后，PBS 液漂洗，經(jīng)過(guò)在 37 ℃ 溫箱中的避光孵育 20 min，PBS液漂洗，DAB顯色，脫水透明封片。陰性對(duì)照用濃 度為0.01 mol / L PBS 液代替一抗。鏡下觀察，PI3-K、p-AKT陽(yáng)性細(xì)胞的胞核部分和胞漿部分呈現(xiàn)出棕黃色，記錄 PI3-K、p-AKT陽(yáng)性細(xì)胞占整個(gè)視野的比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，顯著性水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分

模型組和異氟烷預(yù)處理組的大鼠在腦缺血再灌注后，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀主要表現(xiàn)為： 左前肢不能完全伸展； 爬行時(shí)由于左側(cè)肌力下降。模型組與異氟烷預(yù)處理組分別與假手術(shù)組相比，評(píng)分均較高（ P< 0.01） ； 異氟烷預(yù)處理組與模型組相比，評(píng)分低于模型組（ P<0.05） （見(jiàn)表1）。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，急性腦缺血的病理機(jī)制主要與興奮性氨基酸、細(xì)胞內(nèi)鈣離子

超載、氧自由基、炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)[2]。PI3-K/AKT該信號(hào)通路參與了腦缺血的病理過(guò)程，而且在缺血早期即給予外源因子提高AKT的表達(dá)可以減少缺血腦組織的損傷[3]。PI3-K/AKT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是膜受體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，在心臟、腎臟、 肝臟等多種器官缺血再灌注損傷中發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，模型組大鼠腦缺血再灌注后形成腦梗死灶，腦組織中PI3-K、AKT表達(dá)率較假手術(shù)組顯著增高，這說(shuō)明PI3-K、AKT參與了缺血再灌注損傷過(guò)程。

綜上所述，經(jīng)異氟烷預(yù)處理后，大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低，損傷程度更小。腦組織PI3-K、AKT表達(dá)率較假手術(shù)組顯著增高。可見(jiàn)，異氟烷預(yù)處理通過(guò)上調(diào)PI3-K、AKT信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

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