徐丹丹 趙邯鄲 王秀然 關淑艷
摘要:從富含有機質的環(huán)境中采集土樣,通過植酸鈣平板透明圈法初篩得到產植酸酶菌株,進而用釩-鉬酸銨法和丙酮-磷鉬酸銨法2種方法測定植酸酶酶活力,并進行比較。結果表明,釩-鉬酸銨法為準確、可用的方法,通過正交試驗確定了最適產酶發(fā)酵條件為pH 5,可溶性淀粉用量1.25 g/100 mL,酵母粉用量1.80 g/100 mL,植酸鈣用量1.0 g/100 mL。
關鍵詞:植酸酶;酶活;測定;釩-鉬酸銨法;丙酮-磷鉬酸銨法
中圖分類號:Q93-332? ? ? ? ?文獻標識碼:A
文章編號:0439-8114(2019)12-0134-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.031? ? ? ? ? ?開放科學(資源服務)標識碼(OSID):
Abstract: The soil sample was collected from the organic-rich environment, and phytase production strains were obtained by preliminary screening with calcium phytate plate transparent ring method. Then phytase activity was determined by two different methods vanadium-ammonium molybdate method and acetone-ammonium phosphomolybdate method, and then compared. The results showed that the method of vanadium-ammonium molybdate was accurate and available. The orthogonal fermentation test determines that pH is 5, the yield of soluble enzyme is 1.25 g/100 mL, the optimum dosage of yeast powder is 1.80 g/100 mL, and the amount of calcium phytate is 1.0 g/100 mL.
Key words: phytase; enzyme activity; measure; vanadium-ammonium molybdate method; acetone-ammonium phosphomolybdate method
植酸(肌醇六磷酸)及植酸鹽廣泛存在于植物體中,是植物磷的主要貯存形式,占植物中總磷的60%~80%[1]。但植酸磷難以被單胃動物吸收利用,隨糞便排出體外會造成水體和土壤的嚴重磷污染[2]。同時,植酸及其鹽還是一種抗營養(yǎng)因子,能與多種金屬離子螯合并能與蛋白質等形成難溶的復合物,影響動物對礦質元素和蛋白質的吸收利用[3,4]。植酸酶能將植酸及其鹽類降解為肌醇和磷酸(或磷酸鹽),作為飼料添加劑可以提高植酸磷的利用率,提高植物性飼料的營養(yǎng)價值,減少畜禽糞便中磷的排放,減輕環(huán)境污染[5-7]。傳統(tǒng)的產植酸酶菌株的篩選方法為透明圈法,該方法利用微生物在植酸酶篩選培養(yǎng)基上降解植酸鈣,在菌落周圍生成透明圈來初步判斷微生物是否產植酸酶,但有些產酸菌株也能降解植酸鈣產生透明圈,故平板透明圈法缺乏特異性和絕對性,必須再對產透明圈的菌株進行液體發(fā)酵培養(yǎng),測定發(fā)酵液的植酸酶活性,才能判斷出該菌株是否能夠產植酸酶。植酸酶活性的測定方法較多,有釩-鉬酸銨法、硫酸亞鐵-鉬藍法、丙酮-磷鉬酸銨法、微板法和微量比色法等[8]。本研究從土壤中粗篩出產植酸酶的菌株,通過釩-鉬酸銨法和丙酮-磷鉬酸銨法2種方法測定酶活力,確定最適宜本試驗菌株的酶活測定方法,為后續(xù)試驗奠定基礎。
1? 材料與方法
1.1? 菌株
試驗菌株為前期實驗室所篩產植酸酶菌株。
1.2? 主要試劑
植酸鈉(P8810,Sigma公司);植酸鈣(阿拉丁試劑);其余試劑均為分析純。
1.2.1? 丙酮-磷鉬酸銨法? 丙酮-磷鉬酸銨法測定酶活所需試劑如表1所示。
1.2.2? 釩-鉬酸銨法? 釩-鉬酸銨法測定酶活所需試劑如表2所示。
1.3? 主要設備
721型分光光度計,PHS-3TC型精密數顯酸度計,離心機。
1.4? 方法
1.4.1? 粗酶液的獲得? 將實驗室前期篩選的植酸酶菌株用馬丁斜面進行活化,再從活化斜面取孢子接入4瓶盛有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,置于26 ℃、150 r/min搖床發(fā)酵4 d,過濾離心獲得發(fā)酵上清液。
1.4.2? 發(fā)酵條件的研究? 實驗室前期已經篩選出最適碳源為可溶性淀粉,氮源為酵母粉。對二者用量進行發(fā)酵優(yōu)化,以確定最佳碳氮源以及植酸鈣用量,同時選出產酶最適的pH,發(fā)酵獲得的粗酶液分別用2種方法進行酶活測定。
1)可溶性淀粉用量。將淀粉按0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g/100 mL添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中,確定其最佳用量。
2)酵母粉用量。將酵母粉按1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 g/100 mL添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中,確定其最佳用量。
3)植酸鈣用量。調整培養(yǎng)基中植酸鈣的用量,在培養(yǎng)基中分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/100 mL,測定酶活,以確定植酸鈣的最佳用量。
4)初始pH篩選。調節(jié)培養(yǎng)基的初始pH,使其分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10,測定酶活,以確定產酶最適初始pH。
1.4.3? 丙酮-磷鉬酸銨法測定不同發(fā)酵條件下植酸酶酶活
1)磷標準曲線的繪制。配制濃度分別為0.9、1.2、1.8、2.4、3.0 mmoL/L的磷酸二氫鉀溶液,各吸取2 mL,再加入顯色液AAP 8 mL,搖勻顯色5 min,加入1.0 mL檸檬酸溶液,混勻后在415 nm處比色測定,繪制磷濃度與吸光度的關系曲線,以不加磷酸二氫鉀溶液而補加去離子水作為空白。
2)酶活測定。以每分鐘從一定濃度的植酸鈉溶液中釋放1 nmol無機磷為一個酶活單位(U),稀釋發(fā)酵液到酶活標準曲線范圍內,吸取酶液0.5 mL,加入植酸鈉溶液0.5 mL。37 ℃水浴60 min,然后加入顯色液AAP 8 mL,搖勻顯色5 min,加入1.0 mL檸檬酸溶液,以檸檬酸滅活的稀釋酶液相同處理作為對照在415 nm處比色測定。
式中,P為對照標準曲線查得的反應液中總磷的濃度;P0為對照標準曲線查得的反應液中本底磷的濃度;20為分析酶液時的總稀釋倍數;n為稀釋酶液的總稀釋倍數;t為酶反應時間。
1.4.4? 釩-鉬酸銨法測定不同發(fā)酵條件下植酸酶酶活
1)磷標準曲線的制備。將磷酸二氫鉀母液按照梯度進行稀釋,稀釋倍數為2、4、8、16、32倍,溶液濃度分別為25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5 mol/L,在415 nn波長下測定吸光度,以吸光度為縱坐標,無機磷濃度為橫坐標,列出直線回歸方程。
2)酶活測定方法。以每分鐘從一定濃度的植酸鈉溶液中釋放1 nmol無機磷為1個酶活單位(U)。取10 mL試管進行操作。首先將0.9 mL乙酸緩沖液與0.2 mL待反應液混合,水浴鍋37 ℃預熱5 min,然后加入2 mL植酸鈉,混勻后水浴鍋37 ℃水解30 min,最后加入2 mL終止液。反應后的試樣在室溫下靜置10 min,如出現混濁需在離心機上4 000 r/min離心10 min,取上清液以標準空白調零,在分光光度計415 nm波長處測定樣品吸光度,根據公式計算酶活。
式中,U為試樣中植酸酶的活性(U/mL);c為根據實際樣液的吸光度由直線回歸方程計算出的y值;F為試樣溶液反應前的總稀釋倍數;v為試樣反應體積(mL);30為反應時間(min)。
2? 結果與分析
2.1? 不同方法測定酶活磷標準曲線的繪制
2.1.1? 丙酮-磷鉬酸銨法磷標準曲線? 按照“1.4.3”的方法制作磷標準曲線,以磷濃度為橫坐標,OD415 nm的值為縱坐標繪制磷標準曲線,結果如圖1所示。
2.1.2? 釩-鉬酸銨法磷標準曲線? 按照“1.4.4”的方法制作磷標準曲線,以吸光度為縱坐標,無機磷濃度為橫坐標,結果如圖2所示。
2.2? 不同方法測定不同發(fā)酵條件下植酸酶酶活
2.2.1? 可溶性淀粉最佳用量篩選? 將加入不同量淀粉的培養(yǎng)基進行振蕩培養(yǎng),用2種方法測定植酸酶酶活,兩者之間的差異很小,確定出其最佳用量為1.25 g/100 mL,結果如圖3所示。
2.2.2? 酵母粉最佳用量篩選? 將加入不同用量酵母粉的培養(yǎng)基進行振蕩培養(yǎng),用2種方法測定植酸酶酶活,所得酶活變化趨勢相同,確定酵母粉最佳用量為1.80 g/100 mL,結果如圖4所示。
2.2.3? 植酸鈣最佳用量篩選? 由圖5可知,對加入不同植酸鈣的培養(yǎng)基進行振蕩培養(yǎng),用2種方法測定植酸酶酶活,兩者之間的差異很小,確定植酸鈣的最佳用量為1.0 g/100 mL。
2.2.4? 不同初始pH的篩選? 改變培養(yǎng)基中pH,用2種發(fā)法測定粗酶液酶活力,丙酮-磷鉬酸銨法雖然測出了植酸酶的酶活,但均值在60 U/mL左右,沒有顯示出酶活差異,出現較大誤差;通過釩-鉬酸銨法測定植酸酶的酶活,可以看出植酸酶酶活最佳pH為5,結果如圖6所示。
2.3? 正交試驗
將所選的最佳碳氮源淀粉用量、酵母粉用量、初始pH及植酸鈣用量進行正交試驗分析,確定出最佳的培養(yǎng)基成分。由表3可知,影響植酸酶酶活的主次因素為植酸鈣用量(A)>可溶性淀粉用量? ?(B)>pH(C)>酵母粉用量(B),其最佳組合方案為A2B2C2D2,即100 mL液體培養(yǎng)基中含有1.25 g淀粉、1.80 g酵母粉、pH 5、植酸鈣1.0 g。
3? 小結
通過搖菌獲得植酸酶粗酶液,通過2種方法對其進行酶活檢測,并進而進行發(fā)酵條件的研究,確定出最佳培養(yǎng)基組成。釩-鉬酸銨法被確定為本試驗最適宜的酶活檢測方法。現在測定植酸酶酶活的方法在逐漸改進,但是也沒有明確的指定測定方法,本試驗采用2種方法測定植酸酶酶活,出現了較大差異,其原因正在進一步驗證中。因本次篩選的植酸酶菌株可能為一種新的菌種,其生理生化規(guī)律有待進一步研究。
參考文獻:
[1] 施安輝,王光玉,李桂杰,等.目前國內外植酸酶研究進展[J].中國釀造,2005,146(5):5-10.
[2] 梁欣,于曉麗.植酸酶在家禽飼料中應用的研究進展[J].山東畜牧獸醫(yī),2012,183(4):81-83.
[3] SONI S K,MAGDUM A,KHIRE J M.Purification and characterization of two distinct acidic phytases with broad pH stability from Aspergillus niger NCIM 563[J].World J Microbiol Biotechnol,2010,26(11):2009-2018.
[4] LIEBERT F,PORTZ L.Different sources of microbial phytase in plant based low phosphprus diets of Nile tilapia Oreochromis niloticus may provide different effects on phytate degradation[J].Aquaculture,2007,267(1-4):292-299.
[5] ZHANG R,YANG P L,HUANG H Q,et al.Two types of phytases(histidine acid phytase and beta-propeller phytase) in Serratia sp. TN49 from the gut of Batocera horsfieldi(coleoptera) larvae[J].Curr Microbiol,2011,63(5):408-415.
[6] HUANG H,ZHANG R,FU D,et al. Diversity,abundance and characterization of ruminal cysteine phytases suggest their important role in phytate degradation[J].Environ Microbiol,2011,
13(3):747-757.
[7] FORTES-SILVA R,SANCHEZ-VAZQUEZ F J,MARTINEZ F J.Effects of pretneating a plant-based diet with phytase on diet selection and nutrient uticization in European sea bass[J].Aquaculture,2011,319(3):417-422.
[8] 程海娜.黑曲霉植酸酶菌株選育及其酶的分離純化和性質研究[D].長沙:湖南師范大學,2003.
收稿日期:2019-01-15
作者簡介:徐丹丹(1989-),女,吉林德惠人,在讀碩士研究生,研究方向為重要農藝性狀基因的分離功能鑒定及品種改良,