不同方法分析工礦復(fù)墾區(qū)不同植物根際微生物多樣性的比較

張變?nèi)A　靳東升　郜春花　郜雅靜　李建華

摘要：以山西古交屯蘭工礦復(fù)墾區(qū)為研究對(duì)象，從不同植物種植、不同耕作制度的視角出發(fā)，將傳統(tǒng)分析與現(xiàn)代技術(shù)分析相結(jié)合，分析比較工礦復(fù)墾區(qū)植物根際微生物的多樣性，旨在為提高工礦區(qū)復(fù)墾的土壤質(zhì)量提供理論依據(jù)。傳統(tǒng)分析結(jié)果表明，豆科植物根際微生物細(xì)菌與放線菌的數(shù)量要高于禾本科植物，毛苕子根際細(xì)菌、放線菌數(shù)量與Shannon多樣性指數(shù)均高于其他植物，在大豆—玉米—玉米輪作制度下，大豆根際細(xì)菌、放線菌數(shù)量與Shannon多樣性指數(shù)高于玉米—大豆—大豆輪作制度下玉米根際的相應(yīng)指標(biāo)。用16S rDNA V3～V4區(qū)操作分類單元（operational taxonomic units，簡稱OTU）進(jìn)行不同植物根際細(xì)菌α多樣性分析，發(fā)現(xiàn)自然恢復(fù)土壤的Chao1豐富度高于種植植物的土壤，與種植植物根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)截然不同，連種毛苕子根際與玉米—大豆—大豆輪作制度下的玉米根際土壤具有豐度較低的相似性微生物屬，大豆與苜蓿的根際微生物具有相似的親緣性。

關(guān)鍵詞：工礦復(fù)墾區(qū);植物根際;微生物多樣性;Shannon多樣性指數(shù)

中圖分類號(hào)： S154.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）04-0223-04

土壤微生物是維持土壤活性的重要組成部分，參與有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)等多種生化過程，其多樣性是評(píng)價(jià)土壤環(huán)境質(zhì)量的重要生物學(xué)指標(biāo)[1]。礦區(qū)復(fù)墾土壤具有有機(jī)質(zhì)含量低、團(tuán)聚體少、微生物活性差的特點(diǎn)，然而提高礦區(qū)復(fù)墾土壤質(zhì)量可以緩解我國人均耕地少、質(zhì)量差的現(xiàn)狀，并保持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。根際是連接植物、土壤和微生物的紐帶，植物根系通過分泌物、脫落物與植物殘?bào)w等影響根際土壤微生物群落代謝與種群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變根際土壤環(huán)境[2]。了解不同植被類型根際土壤的理化及微生物學(xué)特性，可以直接或間接反映植被對(duì)土壤的改良作用及植被恢復(fù)的生態(tài)效果。當(dāng)前國內(nèi)外的相關(guān)研究主要集中在根際與非根際土壤理化性質(zhì)、土壤微生物多樣性、土壤酶活性等方面[3-5]，目前僅有少量學(xué)者在工礦區(qū)開展了不同植物根際的評(píng)價(jià)研究[6-11]，對(duì)于山西工礦復(fù)墾區(qū)不同植物根際生物學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究較少。因此，將山西省古交屯蘭礦區(qū)復(fù)墾地作為試驗(yàn)區(qū)，研究在種植不同植物的條件下根際土壤微生物多樣性特點(diǎn)具有重要意義，可以為土壤質(zhì)量改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)位于山西省古交屯蘭工礦復(fù)墾區(qū)，于2014年開始復(fù)墾，試驗(yàn)時(shí)為復(fù)墾第4年，該區(qū)年均氣溫為9.5 ℃，平均降水量為460 mm，為溫帶大陸性氣候，鄉(xiāng)土作物為玉米、大豆。本試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)小區(qū)，分別為大豆—玉米—玉米輪作區(qū)、玉米—大豆—大豆輪作區(qū)、連作苜蓿區(qū)、連作毛苕子區(qū)、自然恢復(fù)區(qū)。2017年，在大豆—玉米—玉米輪作區(qū)種植大豆，在玉米—大豆—大豆輪作區(qū)種植玉米。

1.2 材料與方法

土樣采集。在2017年9月在各試驗(yàn)區(qū)內(nèi)選擇大小差不多的大豆15株，玉米5株;對(duì)于種植苜蓿、毛苕子與自然恢復(fù)的小區(qū)，劃定1 m×1 m區(qū)域采集樣品，設(shè)3次重復(fù)。采用抖落法[12]抖掉大塊土壤，用毛刷輕輕地將根上0～5 mm的土壤刷下作為根際土，收集在無菌塑料袋中，再放入裝有冰袋的保溫箱內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行化驗(yàn)，不能進(jìn)行及時(shí)化驗(yàn)的放入 -80 ℃ 冰箱中保存。

試驗(yàn)方法。（1）采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法測定土壤微生物數(shù)量，細(xì)菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌培養(yǎng)采用高氏改良培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)采用孟加拉紅培養(yǎng)基。微生物數(shù)量以單位質(zhì)量（g）干土中的菌落數(shù)表示。（2）稱取10 g根際土壤，放入滅菌的、裝有90 mL 0.85% NaCl的帶玻璃珠的三角瓶中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上于250 r/min充分振蕩30 min，連續(xù)2次進(jìn)行10倍稀釋后，在Biolog生態(tài)微板的每個(gè)孔中加入150 μL土壤接種液，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用Biolog分析儀每隔24 h讀取各孔的吸光度，連續(xù)測定7 d。（3）16S rDNA高通量測序，由上海派森諾生物公司對(duì)植物根際進(jìn)行微生物組DNA提取、目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收純化、熒光定量等，用MiSeq測序儀測定不同植物根際微生物V3～V4區(qū)的操作分類單元（operational taxonomic units，簡稱OTU）。

數(shù)據(jù)分析。用Excel、SPSS及R軟件進(jìn)行方差分析與聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)結(jié)果

2.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果 從圖1可以看出，豆科植物毛苕子、苜蓿、大豆的根際細(xì)菌數(shù)量要高于禾本科植物玉米的根際細(xì)菌數(shù)量，毛苕子根際土壤的細(xì)菌數(shù)量最多，根際土壤細(xì)菌數(shù)量排序?yàn)槊孀?大豆>自然恢復(fù)>苜蓿>玉米。

2.1.2 放線菌培養(yǎng)結(jié)果 從圖2可以看出，豆科植物毛苕子、苜蓿、大豆的根際放線菌數(shù)量要高于禾本科植物玉米的根際放線菌數(shù)量，但是苜蓿、玉米、大豆與自然恢復(fù)的根際放線菌數(shù)量相差不大，根際放線菌數(shù)量排序?yàn)槊孀?苜蓿>大 豆> 自然恢復(fù)>玉米。

2.1.3 真菌培養(yǎng)結(jié)果 從圖3可以看出，豆科植物苜蓿、大豆的根際真菌數(shù)量要高于禾本科植物玉米的根際真菌數(shù)量，也高于自然恢復(fù)的，連種毛苕子的根際真菌數(shù)量最少，各個(gè)條件下的真菌數(shù)量排序?yàn)榇蠖?苜蓿>自然恢復(fù)>玉米>毛苕子。

2.2 用Biolog生態(tài)微板分析微生物代謝功能的多樣性

2.2.1 不同植物根際微生物群落土壤微生物的平均顏色變化率（AWCD）的動(dòng)態(tài)變化 AWCD表示微平板孔中顏色的平均變化率，用來描述土壤微生物的代謝活性，計(jì)算公式如下：AWCD值=[∑（C-R）]/95[13]。其中：C是所測95個(gè)反應(yīng)孔的吸光度，R是對(duì)照孔的吸光度。

從圖4可以看出，不同植物根際微生物群落的AWCD值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加均呈現(xiàn)增長的趨勢(shì)，土壤微生物群落利用碳源的能力逐漸增強(qiáng)。從接種到培養(yǎng)24 h，各處理樣品平均吸光度無明顯變化，微生物幾乎沒有代謝碳源。在培養(yǎng) 24 h 后的任何時(shí)間段，毛苕子的AWCD值最高，說明其碳源利用速率高，根際土壤微生物活性較高。在培養(yǎng)24～48 h內(nèi)，自然恢復(fù)（NR）的AWCD值要高于玉米、苜蓿，但是培養(yǎng)48 h后，其利用的碳源量雖然在逐漸增加，但是增長緩慢，在培養(yǎng)72 h后的任何時(shí)間段均低于種植其他植物的，且在培養(yǎng)72 h后的任何時(shí)間點(diǎn)，植物根際的AWCD值均表現(xiàn)為毛苕子>大豆>苜蓿>玉米>自然恢復(fù)。

2.2.2 不同植物根際微生物多樣性指數(shù)的差異 微生物多樣性指數(shù)表征整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物群落利用碳源類型的多少，即功能多樣性。表征土壤微生物代謝功能多樣性的指標(biāo)為土壤微生物香農(nóng)-維納指數(shù)H′、Shannon多樣性指數(shù)H、Mclntosh均一度指數(shù)U和Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D[14]，計(jì)算公式見表1。

本研究采用96 h的數(shù)據(jù)來分析計(jì)算土壤微生物多樣性指數(shù)，由表2可見，工礦區(qū)不同植物根際土壤微生物群落的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）均無顯著差異，毛苕子根際土壤微生物群落Shannon指數(shù)H與均一度指數(shù)U顯著高于其他植物（P<005），且根際土壤微生物群落香農(nóng)-維納指數(shù)H′也高于自然恢復(fù)與禾本科植物玉米。自然恢復(fù)的均一度指數(shù)與Shannon指數(shù)H最低，與玉米、苜蓿的香農(nóng)-維納指數(shù)H′均無顯著差異，但是顯著低于輪作大豆根際土壤微生物群落的香農(nóng)-維納指數(shù)H′（P<0.05），說明該礦區(qū)自然恢復(fù)的土壤微生物利用碳源的能力較差，代謝功能差，活性較低。而毛苕子根際土壤利用碳源的能力最強(qiáng)，活性最高。不同輪作制度下大豆與玉米相比大豆根際土壤活性較強(qiáng)，利用碳源能力高于玉米根際，在工礦復(fù)墾初期豆科與禾本科植物輪作與連作豆科植物對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不同。

2.2.3 16S rDNA根際細(xì)菌α多樣性分析 微生物群落α多樣性可以用多種指數(shù)來反映，本研究選用Chao1豐富度估計(jì)指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)。一般而言，Chao1指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。Shannon多樣性指數(shù)綜合考慮了群落的豐富度和均勻度。Shannon指數(shù)越高，表明群落的多樣性越高。從表3可以看出，自然恢復(fù)的根際土壤Chao1指數(shù)最大，輪作大豆根際土壤的Chao1指數(shù)最小，苜蓿根際土壤的Shannon指數(shù)最高，而輪作玉米根際土壤的Shannon指數(shù)最小。

根據(jù)樣本間的相似程度對(duì)豐度排名前50位的屬進(jìn)行聚類并繪制熱圖，對(duì)高豐度和低豐度的分類單元加以區(qū)分，以顏色梯度反映樣本之間的群落組成相似度。從圖5可以看出，主要可以分為自然恢復(fù)與種植植物2類， 其中種植植物類可以分為2類，自然恢復(fù)根際土壤中豐度較高的微生物屬主要有Mycobacterium（分枝桿菌屬）、Cryobacterium（喜冷桿菌屬）、Caenimonas、Ramlibacter（沙壤土桿菌屬）、Gaiella（放線菌屬）、

Nitrobacter（硝化菌屬）、Nordella（諾德氏菌屬）。在輪作制度下，大豆與連種苜蓿相似的屬主要有Variibacter（變桿菌屬）、Rhizobium（根瘤菌屬）、Ohtaekwangia、Lentzea（倫茨氏菌屬）與Gaiella（放線菌屬），但是豐度均不高;在玉米—大豆—大豆輪作制度下，玉米與連種毛苕子根際細(xì)菌群落的相似屬主要有Pseudoncardia（諾卡式菌屬）、Microvirga（微枝形桿菌屬）、Aeromicrobium（氣微菌屬）與Nonomuraea（野野村菌屬），豐度也不高。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同方法的優(yōu)點(diǎn)及局限性

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)分析法簡單、快速、易操作，適用于測定具有特殊生理功能的微生物，然而有許多微生物無法培養(yǎng)，難以測定[15-17];Biolog分析主要通過研究對(duì)單一碳源底物利用能力的不同來鑒定微生物群落結(jié)構(gòu)，有方便快速、靈敏度高、分辨率強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[18]，可彌補(bǔ)其他方法無法獲得微生物群體活性信息的不足[19]，但是培養(yǎng)條件的改變可能會(huì)引起微生物對(duì)碳底物實(shí)際利用能力的改變，從而造成一定的誤差，同時(shí)目前標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫中菌種資料不完善，一些種類不能被準(zhǔn)確鑒定，只能得到相似類群[20-21];16S rDNA高通量測序法主要通過提取微生物組總DNA并進(jìn)行定量，擴(kuò)增，純化，測序，從而鑒定微生物菌群結(jié)構(gòu)[22]，但是對(duì)于序列相同的不同細(xì)菌難以進(jìn)行鑒定。

3.2 礦區(qū)不同植物根際微生物多樣性差異

植物影響土壤環(huán)境，有研究表明，不同植物根系分泌物的成分與含量不同，植物根際微生物的功能代謝有差異[23]，因此不同植物對(duì)土壤微生物群落的影響不同[24]。在本研究中，用傳統(tǒng)培養(yǎng)法得到的結(jié)果表明，該工礦復(fù)墾區(qū)不同植物根際微生物數(shù)量不同，豆科植物根際微生物細(xì)菌、放線菌數(shù)量要多于禾本科植物，這可能與豆科植物本身具有較強(qiáng)的固氮能力相關(guān)。Biolog技術(shù)分析表明，不同植物根際微生物利用碳源能力存在差異性，自然恢復(fù)可利用碳源的微生物活性最低，代謝功能最差，可能與復(fù)墾初期自然恢復(fù)土壤有機(jī)質(zhì)含量低有關(guān)，而毛苕子根際微生物活性最高。16S rDNA分析表明，自然恢復(fù)根際微生物與種植植物根際微生物差異大，且微生物豐度最高，但是多樣性指數(shù)低于豆科植物，高于禾本科植物。

3.3 將來的研究方向

本研究區(qū)處于工礦復(fù)墾初期，礦區(qū)生態(tài)環(huán)境恢復(fù)與耕地面積的增加是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵，在民生福祉的建設(shè)中意義重大，因此，需要多種方法與技術(shù)相結(jié)合并進(jìn)行長期監(jiān)測以關(guān)注礦區(qū)土壤質(zhì)量的變化，為礦區(qū)生態(tài)建設(shè)提供理論依據(jù)。

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