流行性腹瀉病毒5株豬安徽流行株S基因的克隆與序列分析

潘孝成，沈?qū)W懷，趙瑞宏，戴 銀，胡曉苗，侯宏艷，周學(xué)利，張丹俊

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省畜禽疫病研究中心，合肥 230031）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，其可導(dǎo)致豬的一種以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為特征的傳染病，尤其以哺乳仔豬受害最嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)100%，病死率平均為50%，10日齡內(nèi)哺乳仔豬死亡率可高達(dá)90%[1]。PEDV為有囊膜的、不分節(jié)段的、單股正鏈RNA病毒，基因組全長約28 kb，編碼有纖突（spike,S）蛋白、小膜（smallenvelope,E）蛋白、膜（membrane,M）蛋白和核衣殼（nucleocapsid,N）蛋白4種主要結(jié)構(gòu)蛋白[2]。PEDVS蛋白對介導(dǎo)宿主中和抗體的產(chǎn)生、免疫介導(dǎo)、特異性受體的結(jié)合及促進(jìn)病毒和細(xì)胞膜融合等方面具有重要意義，PEDVS基因在遺傳進(jìn)化上存在較高的變異性，其基因序列的改變會引起其毒力、抗原表位、病毒嗜性和組織細(xì)胞培養(yǎng)特性等的改變[3-4]。因此，對豬流行性腹瀉地方流行毒株的序列分析，旨在了解PEDV遺傳變異規(guī)律以及為疫苗研制和開展有效防控提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2018年8—12月在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所安徽省畜禽疫病研究中心進(jìn)行。

1.2 主要試劑、材料

RNAiso Plus試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、pMD-18T載體等購自TakaRa公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DH5α、DNA Marker等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（GARV）的抗原快速檢測試劑盒（膠體金試劑）購自BioNote公司。

1.3 病料

病料樣品為刮取的腸道黏膜，采自安徽省境內(nèi)疑似發(fā)生豬流行性腹瀉的豬場（2013—2017年），發(fā)病仔豬臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉，腸道出血，用PEDV、TGEV和GARV的膠體金抗原快速檢測試劑盒檢測，結(jié)果為PEDV陽性，TGEV和GARV均為陰性。

1.4 引物合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PEDV的S基因序列，設(shè)計了 3 對引物，P1、P2，P3、P4 和 P5、P6，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，3對引物共擴(kuò)增基因片段長度約4 600 bp，包含PEDVS基因全長（表1）。

表1 引物序列

1.5 RNA提取及cDNA合成

刮取發(fā)病仔豬小腸黏膜層，按TakaRa公司RNAiso Plus試劑盒說明書提取總RNA，用TakaRa公司1st Strand cDNA Synthesis kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR擴(kuò)增

以合成的cDNA為模板，用引物對P1/P2、P3/P4或P5/P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：cDNA 3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物各 1 μL（10 pmol/μL），Ex-Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 15 μL，擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55℃ 50 s，72℃ 2.5 min，31個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。電泳鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)入DH5α，鑒定的陽性質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7 基因序列分析

采用 DNA Star、DNAMAN、Genetyx 等軟件，將擴(kuò)增序列與GenBank中的11個PEDV分離株的S基因序列進(jìn)行序列比對、同源性分析和遺傳進(jìn)化分析。所用參考毒株序列見表2。

表2 參考株相關(guān)信息

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增和測序結(jié)果

取PEDV膠體金抗原檢測試劑檢測為陽性的，且來自安徽省不同地區(qū)5個豬場的樣品用3對引物分別進(jìn)行進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，3對引物擴(kuò)增的基因片段大小均約為1 500 bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。測序結(jié)果顯示，獲得5株P(guān)EDV流行毒株的S基因序列，序列全長均為4 161個核苷酸，編碼1 386個氨基酸，將它們分別命名為AH-CS、AHSC、AH-LY、AH-NY 和 AH-SH。

圖1 PEDV S基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 PEDV S基因核苷酸同源性分析

將本試驗得到的5株安徽地方流行毒株（AHCS、AH-SC、AH-LY、AH-NY 和 AH-SH）與參考毒株（AH2012、CH-SDLY-1-2012、CH-weishi-2016、CHJXJA-2017、CHS、LZC、attenuated DR13、IA1、USAColorado-2013、MEX-GTO-2014、CV777） 進(jìn)行S基因核苷酸序列同源性分析，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，5株安徽地方流行毒株S基因核苷酸序列之間的同源性為98.7%～99.8%，與經(jīng)典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我國分離株（LZC和CHS）序列同源性較低，為93.6%～94.4%；與2011年后的我國分離株（AH2012、CH-SDLY-1-2012、CH-weishi-2016、CH-JXJA-2017）、美國分離株（IA1 、USA-Colorado-2013）和墨西哥分離株（MEX-GTO-2014）序列同源性較高，為98.1%～99.8%。

圖2 PEDV S基因核苷酸序列同源性分析

2.3 PEDV S基因遺傳進(jìn)化分析

將本試驗得到的5株安徽地方流行毒株（AHCS、AH-SC、AH-LY、AH-NY 和 AH-SH）與參考毒株（AH2012、CH-SDLY-1-2012、CH-weishi-2016、CHJXJA-2017、CHS、LZC、attenuated DR13、IA1、USAColorado-2013 、MEX-GTO-2014、CV777）的S基因核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果見圖3。進(jìn)化樹分為G1和G2兩個群，G2又被分為G2a和G2b兩個分支，經(jīng)典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2010年前我國分離株（LZC和CHS）組成G1群，本試驗分離5株安徽地方流行株均在G2群，其中 4株（AH-CS、AH-SC、AH-NY 和AH-SH）與我國分離株（AH2012、CH-SDLY-1-2012）在 G2b 群，AH-LY與中國分離株（CH-weishi-2016、CH-JXJA-2017）、美國分離株（IA1、USA-Colorado-2013）和墨西哥分離株（MEX-GTO-2014）在G2a群。

圖3 PEDV S基因的核苷酸序列進(jìn)化樹

2.4 PEDV S 基因序列分析

將本試驗得到的5株安徽地方流行毒株（AHCS、AH-SC、AH-LY、AH-NY 和 AH-SH）與參考毒株（AH2012和CV777）的S基因氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，這5株安徽流行毒株氨基酸序列與AH2012高度相似，僅存在6～19個氨基酸的不同；與參考的經(jīng)典毒株CV777相比，均存在較大差異，存在94～106個氨基酸位點的突變，其中均存在5個氨基酸（58～59位之間插入氨基酸QGVN，135～136位之間插入氨基酸N）的插入和2個氨基酸的缺失（158～159位缺失氨基酸DI）；氨基酸突變位點主要集中在S1區(qū)（1～789aa），占S基因總突變位點的75.47%～81.00%。

3 討論

豬流行性腹瀉病毒的S基因是其基因組中的關(guān)鍵毒力基因，PEDV變異主要集中在S基因上，其遺傳變異往往造成毒株毒力和抗原表位等的改變。本研究獲得了5株P(guān)EDV安徽流行毒株的S基因全長序列，序列全長均為4 161個核苷酸，編碼1 386個氨基酸，序列比對結(jié)果顯示，5株P(guān)EDV流行毒株的S基因核苷酸序列高度同源（98.7%～99.8%），與2011年后的國內(nèi)外分離株（AH2012、CH-SDLY-1-2012、CH-weishi-2016、CH-JXJA-2017、IA1、USAColorado-201、MEX-GTO-2014）序列同源性較高，為98.1%～99.8%；與經(jīng)典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我國分離株（LZC和CHS）序列同源性較低，為 93.6%～94.4%；另外，與 CV777相比，均存在5個氨基酸（58～59位之間插入氨基酸QGVN，135～136位之間插入氨基酸N）的插入和2個氨基酸的缺失（158～159位缺失氨基酸DI）；序列進(jìn)化分析也表明，5株P(guān)EDV分離株與經(jīng)典毒株、疫苗株和2011年前我國分離株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這與毛黎紅等、陳慧娟等、王隆柏等、吳旺霞等、王飛等的研究結(jié)果一致[5-10]。綜上推測，2011年以來我國PEDV主要流行毒株有相同的毒株來源，且較之前發(fā)生了較大的變異；2011年至今中國PEDV流行毒株無較大差異，且與2011年后世界各國的主要流行毒株同源性較高、親緣關(guān)系較近。但2011年后世界各國主要流行PEDV毒株的來源仍需進(jìn)一步研究。

2010年底開始，豬流行性腹瀉在我國呈暴發(fā)性流行，2011—2012年流行面積進(jìn)一步擴(kuò)大，疫情繼續(xù)蔓延，一些地區(qū)流行較為嚴(yán)重[11-13]，2013年、2014年豬流行性腹瀉更是肆虐全球[14-15]，給世界養(yǎng)豬生產(chǎn)者造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然近年來我國豬流行性腹瀉疫苗的使用較為廣泛，但豬流行性腹瀉在我國發(fā)生呈現(xiàn)常態(tài)化，在秋、冬、春季十分常見，其危害仍然十分嚴(yán)重[16]，這可能與 2011年后我國豬流行性腹瀉主要流行毒株較以往毒株和疫苗株出現(xiàn)了較大變異有關(guān)，這就需要開展豬流行性腹瀉防控時，不但要做好生物安全，同時要選擇合適的疫苗進(jìn)行免疫。