尹曉靜，周靜華，王杰

（蘇州市相城區(qū)水產(chǎn)技術推廣站，江蘇 蘇州 215131）

中華絨螯蟹是蘇州地區(qū)的主要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。在養(yǎng)殖過程中，部分養(yǎng)殖戶塘口的中華絨螯蟹出現(xiàn)了活力下降甚至死亡的情況，造成了較大的損失。從患病蟹體內分離到腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）并人工回感成功，該文有關腐敗希瓦氏菌及其藥物敏感性的結果有助于對中華絨螯蟹的細菌性疾病進行預防和治療。

1 材料與方法

1.1 中華絨螯蟹

患病蟹來自相城區(qū)陽澄湖鎮(zhèn)的發(fā)病蟹塘，規(guī)格60～80 g，病蟹十肢無力，行動遲緩，血液凝固慢或不凝。人工回感試驗所用健康蟹購自陽澄湖鎮(zhèn)養(yǎng)殖池塘，平均體質量62 g/只。

1.2 主要試劑和儀器

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、麥康凱瓊脂（MCKA）、RS瓊脂（RSA）（北京陸橋技術有限責任公司）；藥敏板（南京菲恩醫(yī)療科技有限公司）；E/NF生化鑒定板條、BBL Crystl微生物鑒定系統(tǒng)、比濁儀（Becton,Dickinson and Company,USA）。

1.3 細菌分離

將病蟹在自來水中洗刷外殼，并用干凈紗布吸干表面水分，然后以無菌操作打開外殼，取肝臟在TSA平板上劃線分離，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，從平板上形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落中選取單個菌落，再次TSA平板劃線，直至獲得細菌純培養(yǎng)物。再取單個菌落分別劃線于MCKA平板和RSA平板，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況。

1.4 細菌鑒定

1.4.1 生化鑒定 將分離菌純培養(yǎng)物劃線MCKA平板，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h，挑取菌苔至0.85%NaCl生理鹽水中，用比濁儀配制成0.5麥氏濃度菌液，菌液接入E/NF生化鑒定板條，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，板條通過BBL Crystl微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定分析。

1.4.2 PCR擴增與測序 分離菌株16S rDNA的PCR擴增與序列分析委托蘇州泓迅生物科技有限公司完成。

1.5 人工感染

健康蟹分放在5個中轉箱（長×寬×高=60 cm×40 cm×30 cm，水深 10cm）中，充氧，不投餌，室溫空調維持27～28℃，暫養(yǎng)3 d，棄去傷殘體弱，開始試驗。設4個試驗組，每組10只蟹。采用肌肉注射法，每組注射分離菌液濃度分別為 2×108、1×108、0.5×108、0.25×108CFU/mL，每只 0.1mL。同時設一對照組，注射同等量無菌生理鹽水，48h后觀察結果并記錄蟹發(fā)病死亡情況。對剛死的蟹立即進行細菌分離，如果重新分離到接種菌株且為優(yōu)勢菌株，即可以確定蟹發(fā)病死亡是由該菌株造成。采用改良寇氏法計算分離菌株對河蟹的LD50。

1.6 藥敏試驗

采用南京菲恩醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的藥敏板對分離菌進行藥物敏感性測定，選用抗生素如下：恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、紅霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素、強力霉素。

2 結果

2.1 細菌分離

從兩病蟹肝臟分離出12株優(yōu)勢菌株，取代號為SP25。TSA平板培養(yǎng)24 h后可見各優(yōu)勢菌株呈現(xiàn)出相同的菌落形態(tài)：菌落圓形，直徑1～2 mm，邊緣整齊，輕度凸起，表面濕潤、光滑，不透明。菌落在TSA、MCK和RSA平板上均生長良好，分別呈淡黃色、黃色和黑色。

2.2 細菌鑒定

2.2.1 生化分析 通過BBL Crystl微生物鑒定系統(tǒng)的生化分析，菌株SP25鑒定為腐敗希瓦氏菌。

2.2.2 序列分析 通過對菌株SP25的16S rDNA的PCR擴增與測序，獲得一段長1 430 bp的序列（GenBank登錄號為 JN555612）。Blast比對結果顯示，菌株SP25與GenBank數(shù)據(jù)庫中檢出的16株Shewanella putrefaciens菌株的相似度均大于98%。

綜合生化分析和序列分析，菌株SP25鑒定確定為腐敗希瓦氏菌。

2.3 人工感染

SP25菌株的人工回感河蟹試驗結果見表1。從表1可見，在感染SP25菌株后48 h，3.23×105CFU/g劑量組的蟹病死率達100%，0.40×105CFU/g劑量組的蟹病死率為20%，而對照組的蟹在試驗期間無病狀和死亡。感染發(fā)病的蟹活力下降、附肢無力，不久便死亡。從剛死亡的病蟹中分離到大量與SP25菌株菌落形態(tài)一致的優(yōu)勢菌株（RSA平板培養(yǎng)菌落呈黑色，BBL Crystl微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為腐敗希瓦氏菌）。測得SP25菌株感染河蟹48 h的LD50為6.17×104CFU/g。

2.4 藥敏試驗

藥物敏感性測試結果見表2。表2可見，菌株SP25對恩諾沙星、硫酸新霉素、鹽酸環(huán)丙沙星較為敏感，對甲砜霉素耐藥。

表1 菌株SP25對河蟹的人工感染試驗

表2 菌株SP25藥物敏感性測試mg/L

3 討論

近年，國內外相繼發(fā)現(xiàn)有腐敗希瓦氏菌感染金帶籃子魚（Siganus rivulatus）[1]、歐洲海鱸（Dicentrarchus labrax）[2]、大黃魚（Pseudosciaena crocea）[3]以及大菱鲆（Scophthalmus maximus）[4]等海水養(yǎng)殖動物的研究報道。作為水產(chǎn)動物的病原菌，卻較少見到腐敗希瓦氏菌感染淡水養(yǎng)殖動物的報告，國外目前僅見 Kozi ska等[5]所發(fā)現(xiàn)的鯉魚（Cyprinus carpio）和鱒魚（Oncorhynchus mykiss）的感染病例，國內也僅見腐敗假單胞菌感染河蟹[6]和腐敗希瓦氏菌感染異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）[7]的有關研究報道。對河蟹進行的人工回感試驗結果表明，分離到的腐敗希瓦氏菌能使健康河蟹致病死亡，病蟹表現(xiàn)出與自然狀態(tài)下感染腐敗希瓦氏菌相似的臨床特征，同時從發(fā)病死亡的蟹體內又重新分離到了該菌株，根據(jù)Koch法則，可以確定腐敗希瓦氏菌即是導致河蟹發(fā)病死亡的致病菌。

腐敗希瓦氏菌是冰鮮魚的主要腐敗菌[8-10]，該試驗采集的病蟹也主要是投喂冰鮮魚餌料，因此，在河蟹養(yǎng)殖中，倡導養(yǎng)殖戶使用顆粒飼料替代冰鮮魚，或冰鮮魚經(jīng)消毒殺菌處理后再投喂，能有效避免腐敗希瓦氏菌的感染，減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟損失。