酪氨酸羥化酶基因新突變導致多巴反應性肌張力障礙家系分析

段麗芬，王惠萍，孫 瑩，王春霞，王左華，張 霞，沈 茹

（昆明市兒童醫(yī)院1.神經(jīng)內(nèi)科

2.檢驗科 云南 昆明 650228）

多巴反應性肌張力障礙（dopa-responsive dystonia，DRD）又稱Segawa病，或伴有明顯晝夜波動的遺傳性進行性肌張力障礙，由日本學者Segawa發(fā)現(xiàn)并報道。DRD的主要臨床表現(xiàn)為肌張力障礙、癥狀多有晨輕暮重現(xiàn)象、小劑量多巴制劑有顯著持久的療效［1］。DRD可分為常染色體顯性遺傳（autosomal dominant，AD）和常染色體隱性遺傳（autosomal recessive，AR），AD-DRD的致病基因有三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶1（guanosine triphosphate cyclohydrolase 1，GCH-1）基因以及DYT14基因，GCH1基因為最常見的致病基因［2］。AR-DRD的致病基因為TH基因和SPR基因，均較為少見，TH基因突變所致的DRD是一種罕見但可治的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病，因此對攜帶有該基因突變的家系進行遺傳分析尤為重要，目前國內(nèi)鮮有TH基因致病的DRD家系報道，現(xiàn)將我院神經(jīng)內(nèi)科診斷的一個家系中2例隱性遺傳的DRD患者進行報道。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集

研究對象為2016年2月就診于我院，來自云南省曲靖市白水鎮(zhèn)一山區(qū)的家系（圖1，表1）。病例經(jīng)小兒神經(jīng)內(nèi)科專家進行病史詳細詢問和詳細體格檢查，臨床診斷標準符合Nygaard等提出的DRD診斷標準。家系中2例患者和1例無癥狀姐姐的臨床表現(xiàn)見表1，I1、I2、I3、I4未能進行基因檢測。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有受試患兒及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

圖1 DRD患者家系圖Fig.1 Pedigree of DRD patients

表1 多巴反應性肌張力障礙一家系2例患者和1例無癥狀親屬的臨床特點Table 1 Clinical characteristics of 2 patients and 1 asymptomatic relationship in a family with dopa reactive dystonia

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集與DNA提取 抽取患者及親屬外周血各2 mL置于帶有EDTA抗凝的采血管中，采用QiagenFlexiGene DNA Kit提取試劑盒（德國，Qiagen公司）提取血液樣本的基因組DNA。提取的DNA采用Nanodrop2000超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）測定其含量。確保樣本基因組DNA的A260/280范圍在1.8～2.0，500 ng/μL ＞ DNA濃度100 ng/μL，基因組總量大于3.5 μg，同時進行瓊脂糖電泳檢測基因組完整性。

1.2.2 二代測序檢測 對已經(jīng)提取的DNA構建DNA樣本文庫，文庫共包含31 654條捕獲探針，總大小為1.035 Mbp。然后進行肌張力及運動障礙的已知致病基因包檢測（共含256個），同時隨機選取我院體檢的50名健康兒童外周血作為對照（男性27名，女性23名，平均年齡5歲，最小4個月，最大14歲，中位數(shù)：4歲，漢族44例，少數(shù)民族6例，昆明市籍20例，地州籍30例）。測序平臺產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)Fastq文件，經(jīng)生物信息學軟件分析、注釋獲得初步檢測結果，經(jīng)數(shù)據(jù)篩選及臨床比對，篩選出TH基因c.1481C ＞ T（p.Thr494Met）、c.943G＞A（p.Gly315Ser）兩個位點，作為可疑位點進行驗證。

1.2.3 一代測序驗證 對先證者及其家系出現(xiàn)的位點進行一代測序驗證。在人類基因組數(shù)據(jù)庫GenBank中獲得上述突變位點基因序列，運用Primer Z設計引物并合成（表2）。反應條件為預變性95℃ 10 min后，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃45 s，循環(huán)35個周期，最后72℃延伸5 min PCR擴增后，對突變位點進行一代測序驗證（ABI 3730一代測序儀），將獲得序列與之前的序列進行比對，排除掉二代測序中假陽性的位點。

表2 反應體系引物的堿基序列Table 2 Primer sequence of reaction system

2 結果

2.1 基因突變分析

測序結果（圖2）顯示家系中2例患者TH基因外顯子14、外顯子9存在c.1481C＞ T（p.Thr494Met）、c.943G＞A（p.Gly315Ser）復合雜合突變，導致蛋白功能受影響，兩個雜合突變中前者來源于母親，后者來源于父親，先證者二姐和50名正常對照者均未檢測到該突變。

圖2 該家系TH基因測序結果Fig.2 The results of sanger sequencing of the TH gene fromⅢ3，Ⅲ1，Ⅱ1，Ⅱ2 andⅢ2 samples were as follows

2.2 蛋白功能軟件預測結果

對上面提到的兩個錯義突變分別進行Ployphen2、Sift和Mutationtaster蛋白功能軟件預測，預測結果提示c.1481C ＞T（p.Thr494Met）、c.943G ＞A（p.Gly315Ser）突變位點可能對蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生損害（圖3）。

圖3 PolyPhen-2軟件對致病性的預測Fig.3 Prediction of pathogenicity by PolyPhen-2 software

3 討論

DRD是一種罕見的常染色體遺傳性疾病，它是由于基因缺陷導致多種酶合成不足而使多巴胺生物合成受阻引起的臨床癥狀，因遺傳異質(zhì)性導致DRD有不同臨床表型，典型表現(xiàn)為兒童期或青少年起病，多以下肢肌張力障礙或步態(tài)異常為首發(fā)癥狀，之后逐漸出現(xiàn)全身進行性肌張力障礙，臨床癥狀有顯著晨輕暮重，對小劑量左旋多巴有戲劇性和持續(xù)性的效果。DRD部分患者會出現(xiàn)下肢反射亢進、肢體痙攣等，極易誤診為腦性癱瘓、少年帕金森、足下垂、遺傳性痙攣性截癱等，長期得不到正確醫(yī)治可能會帶來肢體畸形或廢用性改變，Tadic［3］統(tǒng)計了 1952 年至 2011 年間576例DRD患者起病中位數(shù)年齡為11.6歲，從起病到延誤診斷的中位數(shù)為13.5年，DRD在全球范圍內(nèi)誤診率極高，特別是在癥狀不典型的嬰兒和幼兒中。

在DRD患者中首先發(fā)現(xiàn)的基因為GCH1基因也是目前報道最多的基因［4］，其次為 TH、SPR、PTS、PCBD、QDPR和PARK2基因［5］。TH由TH基因編碼，TH基因定位于11p15.5，含14個外顯子，目前已經(jīng)有文獻報道的TH基因變異位點共有67個（來自HGMD數(shù)據(jù)庫），其中TH基因突變類型有錯義突變、無義突變，剪切位點突變，小的缺失和插入，臨床常見為錯義突變，本次家系檢測結果為錯義突變，和已經(jīng)報道過的TH基因的突變類型多為錯義突變是一致的。TH是兒茶酚胺（多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素）合成的關鍵限速酶，以分子氧和酪氨酸為底物，BH4為輔因子，催化左旋酪氨酸轉變?yōu)樽笮喟停撁溉毕輰е禄坠?jié)突觸間的多巴胺耗竭，患者出現(xiàn)運動障礙或非運動功能障礙如：情緒波動、語言記憶缺陷和專注困難等［6］，本次研究檢測出TH基因的兩個突變位點，其中一個位點為已報道過的c.1481C＞T（p.Thr494Met）突變位點［7］，為致病性突變，另外一個為新發(fā)現(xiàn)的位點c.943G＞A（p.Gly315Ser），檢索HGMD、NCBI數(shù)據(jù)庫該突變?yōu)槲磮蟮肋^的新突變?；純焊改妇鶠閿y帶者，符合常染色體隱性遺傳方式。正常家系成員及50名正常對照個體未檢測到該突變，說明這兩個突變可能是該家系的致病性突變。運用Ployphen2、Sift和Mutationtaster蛋白功能軟件預測，均證實突變位點很可能對蛋白質(zhì)功能造成損害，兩例患兒臨床癥狀符合DRD的診斷同時也通過良好療效驗證了該診斷，進一步說明該突變?yōu)橹虏⌒酝蛔兊目赡苄暂^大。

TH基因缺陷的DRD較GCH1基因突變所致的DRD起病早、臨床癥狀重，多在出生后數(shù)周到5歲間起病，常為下肢起病的部分或全身性肌張力不全，70%在15歲前即可出現(xiàn)嚴重癥狀，可表現(xiàn)為運動遲滯的多巴反應性嬰兒帕金森或嚴重進展性腦病表現(xiàn)等［8］。本家系中先證者為下肢起病，早期晨輕暮重現(xiàn)象明顯，符合該病特點，TH缺陷的DRD晚期晝夜波動性可消失，先證者大姐病程長，癥狀嚴重無晝夜波動性，曾被誤診為腦性癱瘓十余年。TH基因突變的DRD分為3個表型［9］：①嬰幼兒進行性腦?。罕憩F(xiàn)為運動發(fā)育遲滯、波動性的錐體外系癥狀、視覺和植物神經(jīng)癥狀，左旋多巴治療癥狀會有所改善但不持續(xù)不常久。②左旋多巴敏感的嬰幼兒帕金森綜合征：嬰兒起病的嚴重運動障礙但對左旋多巴有較好的敏感性，先證者大姐出生后既有嚴重運動障礙，無晨輕暮重現(xiàn)象，小劑量左旋多巴療效顯著故考慮為該類型。③典型的DRD：下肢起病的肌張力不全，多有晨輕暮重表現(xiàn)，小劑量左旋多巴治療療效顯著，先證者為該類型。本研究中兩例患者基因突變位點完全相同，然而先證者表現(xiàn)為典型的DRD表現(xiàn)，先證者大姐則為左旋多巴敏感的嬰幼兒帕金森綜合征，兩者臨床嚴重程度和起病年齡均不同，考慮可能為基因的遺傳異質(zhì)性導致酶缺陷程度不同而出現(xiàn)不一樣的臨床表現(xiàn)。鑒于DRD的罕見性及缺乏臨床癥狀特異性，臨床醫(yī)生單憑臨床表現(xiàn)很難早期識別，可提供的可靠診斷依據(jù)少導致臨床能確診的病例數(shù)更少。目前基因檢測可以作為一種可靠的手段進一步明確診斷，將來隨著測序成本的降低，可望采用基因測序的方法作為肌張力障礙的常規(guī)診斷篩查方法。雖然DRD具有高誤診率和致殘率，但是治療和改善預后卻有良好的臨床療效，有望未來能列入新生兒基因篩查的疾病譜中。

DRD需與運動障礙性疾病如：腦性癱瘓相關肌張力障礙、少年型帕金森病、肝豆狀核變性、痙攣性截癱、脊髓性肌肉萎縮癥等鑒別。其晨輕暮重現(xiàn)象應與重癥肌無力相鑒別，但晝夜波動不是DRD特異性的表現(xiàn)，其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病等也可能出現(xiàn)晝夜波動性［10］，而對左旋多巴的顯著和持久的反應性是鑒別DRD和其他肌張力不全和帕金森病的重要特征［9］。左旋多巴是DRD最首選的治療，大部分患者對小劑量左旋多巴有戲劇性和持久性的療效，有報道0.4 mg/kg起始既能顯著改善臨床癥狀［11］，有治療了30年療效仍持續(xù)有效的報道［7］，本研究家系中先證者服用左旋多巴每千克體質(zhì)量1.5 mg當天既有明顯效果，先證者大姐臥床11年，經(jīng)治療后取得扭轉性效果，現(xiàn)已能基本正常生活，左旋多巴副作用小，故懷疑DRD的患者均可試驗性治療以免漏診DRD貽誤治療時機。Wijemanne等［12］的研究建議疑似DRD的病例均可進行左旋多巴試驗，假如1個月后仍無反應試驗終止。一旦試驗有反應，立即進行下一步檢查，基因診斷將有助于DRD的盡早診斷。

DRD是一種有較好治療效果的常染色體遺傳病，遺憾于目前其漏診率和誤診率極高，如患兒未得到及時有效治療可導致嚴重肢體殘障。TH基因突變DRD病例相對少見容易遺漏，我們對TH基因家系進行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)了一種新的TH基因突變位點，擴展了DRD的基因型與臨床表型的關系譜。疑似DRD病例可常規(guī)進行左旋多巴試驗或小劑量左旋多巴實驗性治療，如試驗陽性、起病早、臨床癥狀重的患兒需盡早完善TH基因檢測協(xié)助診斷。應增強兒科、康復醫(yī)療人員對DRD的認識，在臨床、基因分析基礎上進行遺傳咨詢實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育，診斷病例及早治療，降低致殘率。

（致謝：康旭醫(yī)學檢驗所在基因檢測分析過程中給予的技術指導。）