廉正義，胡秀彩，呂愛(ài)軍，孫敬鋒，劉小雪，譚靜

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis是我國(guó)名貴的海水魚(yú)類之一[1]。隨著工廠化養(yǎng)殖發(fā)展，舌鰨皮膚潰爛、腹水癥等病害頻繁發(fā)生[2]。研究表明，魚(yú)類皮膚黏液主要由黏蛋白、免疫球蛋白、補(bǔ)體、凝集素和溶菌酶等組成[3]。其中，黏蛋白是一種多功能糖蛋白，主要分為膜結(jié)合型（即細(xì)胞表面黏蛋白）和分泌型兩種類型，已報(bào)道大約有20種黏蛋白，在魚(yú)類抗感染中具有重要作用[4]。對(duì)人和哺乳動(dòng)物研究表明：黏蛋白與疾病免疫密切相關(guān)，已受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注[5-7]。目前發(fā)現(xiàn)膜結(jié)合型黏蛋白MUC1、MUC3、MUC13等基因主要在胃腸道黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、黏附、生長(zhǎng)及免疫調(diào)節(jié)[5,7]。Shoe-maker和LaFrentz等[8]報(bào)道，魚(yú)類運(yùn)輸脅迫可導(dǎo)致皮膚黏液及黏蛋白減少，引起繼發(fā)性細(xì)菌感染。迄今為止，在金頭鯛Sparus aurata等魚(yú)類中也發(fā)現(xiàn)了膜結(jié)合型黏蛋白，包括MUC1、MUC13和MUC18等[9]。但是，關(guān)于半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因克隆表達(dá)研究，目前尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[10-12]。

本研究采用PCR方法擴(kuò)增和克隆了半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因，利用生物信息學(xué)方法對(duì)預(yù)測(cè)分析基因蛋白序列的結(jié)構(gòu)域，為進(jìn)一步研究魚(yú)類黏蛋白在抗病免疫應(yīng)答中的功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)

健康半滑舌鰨體質(zhì)量約為100g，購(gòu)自天津市某水產(chǎn)養(yǎng)殖公司，經(jīng)MS-222麻醉后取皮膚組織保存于液氮中備用。

1.1.2 試劑

Trizol試劑、DEPC處理水、焦碳酸二乙酯DEPC試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，pMD18-T Vector購(gòu)自TaKaRa公司，UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑均購(gòu)自上海捷瑞生物工程公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自ThermoScientific公司，甲磺酸三卡因MS-222購(gòu)自北京格林科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的制備

參照薛春雨等[12]，采用Trizol法提取半滑舌鰨皮膚總RNA，按照RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒的操作步驟，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參考半滑舌鰨基因組黏蛋白基因序列（登錄號(hào):XM025055230）設(shè)計(jì)2對(duì)黏蛋白特異性引物用于PCR擴(kuò)增，引物由金唯智生物科技有限公司合成（表1）。

1.2.3 半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因克隆

以皮膚組織cDNA為模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增黏蛋白CsMUC18基因序列。PCR擴(kuò)增體系為25μL，包括cDNA模板2μL、上下游引物各1μL、Master Mix10μL和ddH2O11μL。PCR循環(huán)程序?yàn)椋?5℃ 2min，95℃ 45s，56℃或 59℃ 45s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNA膠回收試劑盒回收目的基因片段；膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆菌液送金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.4 基因序列及其結(jié)構(gòu)分析

參照李雪等[13]描述方法進(jìn)行，采用ProtParam、TMHMM（https://www.expasy.org/）等在線分析軟件分別預(yù)測(cè)分析黏蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)，MEGA7.0軟件鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因的PCR擴(kuò)增及理化特性分析

圖1 黏蛋白CsMUC18基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of the CsMUC18 gene

表1 黏蛋白CsMUC18 PCR擴(kuò)增的引物序列Tab.1 Primer sequences of the CsMUC18 gene

圖2 半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因上下游引物測(cè)序圖譜和推導(dǎo)氨基酸序列Fig.2 Sequencing of CsMUC18 gene primers and deduced amino acids

圖3 黏蛋白CsMUC18的信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖、跨膜區(qū)、抗原指數(shù)、蛋白親水性及表面可能性分析Fig.3 Signal peptide,transmembrane domain,antigenic index,prediction of hydrophilicity and surface probability of CsMUC18

采用RT-PCR方法擴(kuò)增半滑舌鰨皮膚黏蛋白CsMUC18基因片段，分別獲得特異性片段長(zhǎng)度大小為1000bp和1200bp左右目的條帶，與預(yù)期片段大小一致（圖1），測(cè)序獲得長(zhǎng)度為870bp和1202bp的兩條序列，經(jīng)拼接基因全長(zhǎng)為1934bp，可編碼635aa，引物序列見(jiàn)圖2。預(yù)測(cè)該黏蛋白CsMUC18分子量約為69.38kD、等電點(diǎn)為4.90，1個(gè)信號(hào)肽序列MALRDSACLLLGLLLLCHTWGAWA（1～24aa），包含膜內(nèi)區(qū)（583～635aa）、跨膜區(qū)（560～582aa）和膜外區(qū)（1～559aa），以及 7 個(gè)主要抗原表位區(qū)（67～79、172～177、218～225、552～558、593～605、613～618 和628～635aa）（圖 3）。CsMUC18 蛋白修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：含有8個(gè)糖基化位點(diǎn)N-{P}-[ST]-{P}（PS00001）主要有 Asn96/177/247/308/333/393/477/490，主要有 1 個(gè)蛋白激酶 CK2磷酸化位點(diǎn) [ST]-x（2）-[DE]（PS00006）為 Ser156、5 個(gè)蛋白激酶 C（PKC）磷酸化位點(diǎn)[ST]-x-[RK]（PS00005）為Ser208/263/496/593/603。

2.2 CsMUC18基因序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

采用Blastp檢索比較黏蛋白基因蛋白序列的同源性，結(jié)果顯示CsMUC18與大菱鲆、金頭鯛、斑馬魚(yú)和人黏蛋白MUC18相似性分別為61.31%、58.38%、41.09%和32.69%。選取大菱鲆、金頭鯛、斑馬魚(yú)和人的黏蛋白MUC18等氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示 CsMUC18 在 277～303aa、445～481aa位置存在2個(gè)高變區(qū)。Motifscan檢索發(fā)現(xiàn)：CsMUC18屬于免疫球蛋白家族，其中發(fā)現(xiàn)5個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域（25～138、146～247、253～331、342～421 和 428～498aa），依次為免疫球蛋白V-set區(qū)（Ig superfamily V-set,pfam07686），免疫球蛋白超家族（Igsuperfamily,cl11960）、類免疫球蛋白（Ig superfamily IG-like,smart 00410）、免疫球蛋白超家族2（Ig superfamily IG-2,pfam13895）、免疫球蛋白 I區(qū)（I-set superfamily,cl28434）（圖4）。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載半滑舌鰨、大菱鲆、金頭鯛、斑馬魚(yú)、鼠、牛和人等9個(gè)物種的黏蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。該進(jìn)化樹(shù)分析顯示：MUC1、MUC13和MUC18等屬于膜結(jié)合型黏蛋白，MUC2、MUC5AC和MUC19等屬于分泌型黏蛋白，其中CsMUC18與大菱鲆、金頭鯛和斑馬魚(yú)等魚(yú)類膜結(jié)合型黏蛋白親緣關(guān)系最近，自然聚為一支，與人、鼠、牛的黏蛋白親緣關(guān)系較近；但是與半滑舌鰨、斑馬魚(yú)、人和鼠等物種的分泌型黏蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，聚為另一支（圖5）。

圖4 黏蛋白CsMUC18氨基酸序列比對(duì)與結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.4 Multiple alignment and structural domain prediction of deduced amino acid sequence of the CsMUC18

2.3 半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明：黏蛋白CsMUC18以β折疊為主，其中包含1個(gè)由α螺旋構(gòu)成（568～576aa）的跨膜區(qū)（圖 6A）；三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由 6個(gè)蛋白亞基組成，其中包括細(xì)胞膜外區(qū)域由5個(gè)免疫球蛋白亞基以及細(xì)胞膜內(nèi)區(qū)域1個(gè)蛋白亞基組成，與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致（圖6B）。

圖5 不同物種黏蛋白與半滑舌鰨CsMUC18氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of the mucin amino acids sequences in CsMUC18 between semi-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis and different species

3 討論

半滑舌鰨是一種海水底棲魚(yú)類，其皮膚、鰓等黏膜組織損傷易導(dǎo)致病原感染[14]。魚(yú)類皮膚黏液是阻止病原微生物入侵的第一道防線，其黏膜免疫應(yīng)答對(duì)病原體的防御尤其重要[15]。黏蛋白是黏液的主要成分，分為膜結(jié)合型和分泌型兩種類型[4,16]。Adamek等[17]分析了病毒誘導(dǎo)鯉Cyprinus carpio黏蛋白基因在皮膚、鰓和腸道黏膜組織中的表達(dá)，表明病毒感染后鰓和腸道黏蛋白基因mRNA表達(dá)水平下降，往往造成黏膜組織受損感染加重。Perez-Sanchez等[7]報(bào)道，膜結(jié)合型黏蛋白MUC18在魚(yú)類皮膚和鰓中表達(dá)豐富，具有免疫防御、促進(jìn)機(jī)體發(fā)育和調(diào)節(jié)滲透壓平衡等多種功能。研究證實(shí)，人黏蛋白MUC18表達(dá)水平異常變化與免疫相關(guān)疾病發(fā)生有關(guān)[18,19]。Bai等[20]報(bào)道，在人腫瘤組織中黏蛋白MUC18基因表達(dá)水平顯著性降低，這與腫瘤細(xì)胞增殖擴(kuò)散有關(guān)。研究表明，人呼吸道上皮細(xì)胞表面黏蛋白MUC1參與銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa黏附素的黏附結(jié)合過(guò)程，唾液黏蛋白對(duì)口腔及牙齒健康有保護(hù)作用，認(rèn)為在口腔干燥癥和齲病防治有應(yīng)用前景[21,22]。

迄今，針對(duì)魚(yú)類皮膚黏蛋白基因克隆表達(dá)的研究相對(duì)較少[7,11,12]。關(guān)于半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因克隆及生物信息學(xué)分析，目前未見(jiàn)有報(bào)道。Perez-Sanchez等[7]對(duì)金頭鯛膜結(jié)合型黏蛋白MUC13和MUC18研究表明，MUC18在鰓和皮膚中表達(dá)豐富，屬于免疫球蛋白家族基因，含有5個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18主要包含免疫球蛋白V-set區(qū)（Ig superfamily V-set），Ig 超家族（Ig superfamily）、類 Ig（Ig-like）、Ig超家族 2（Ig-2）和免疫球蛋白 I-set區(qū)（I-set superfamily）等免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域，推測(cè)CsMUC18為免疫球蛋白家族基因，這與報(bào)道的其他魚(yú)類黏蛋白MUC18結(jié)果一致[7]。本文選擇黏蛋白MUC1、MUC13和MUC18等22個(gè)黏蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示半滑舌鰨CsMUC18屬于膜結(jié)合型黏蛋白，與大菱鲆、金頭鯛黏蛋白MUC18親緣關(guān)系較近，關(guān)于MUC18的生理及免疫功能需要進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因克隆及生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)黏蛋白CsMUC18含有1個(gè)信號(hào)肽、5個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域及1個(gè)跨膜區(qū)，為今后深入研究海水魚(yú)類黏蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

圖6 黏蛋白CsMUC18的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Structure prediction of CsMUC18