連續(xù)流動(dòng)法快速測(cè)定基因編輯素材中淀粉含量

黃海濤，許 永，王 晉，劉 欣，孔維松，楊葉昆，李雪梅，楊光宇，張承明，李 晶

云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明市高新區(qū)科醫(yī)路41 號(hào) 650106

淀粉是高等植物中碳水化合物貯藏的主要形式，成熟的新鮮煙葉中淀粉含量高達(dá)40%。與其他植物相比，新鮮煙葉中的淀粉只是碳水化合物的暫時(shí)貯存形態(tài)。煙葉經(jīng)調(diào)制、發(fā)酵后，淀粉大部分轉(zhuǎn)化為小分子碳水化合物，而小分子碳水化合物在卷煙燃吸過程中會(huì)裂解產(chǎn)生酸性物質(zhì)，這些酸性物質(zhì)在中和含氮化合物燃燒過程中產(chǎn)生的堿性物質(zhì)方面發(fā)揮重要作用，因此，要提高烤煙的感官品質(zhì)必須平衡好烤煙煙葉中淀粉含量與煙堿、含氮化合物含量之間的關(guān)系。鑒于適宜的淀粉含量對(duì)卷煙香氣和吸味品質(zhì)的重要性［1-4］，準(zhǔn)確測(cè)定烤煙煙葉中的淀粉含量對(duì)于煙葉和卷煙產(chǎn)品的品質(zhì)評(píng)價(jià)具有重要意義。

目前煙草樣品中淀粉含量的測(cè)定方法主要有分光光度法［5-6］、連續(xù)流動(dòng)分析法［7-11］、高效液相色譜法［12］、離子色譜法［13］、近紅外光譜法［14］等。采用高效液相色譜法和離子色譜法測(cè)定煙草中的淀粉時(shí)，需要先脫除煙草樣品中的水溶性糖，然后用酸或酶將淀粉水解為單糖進(jìn)行測(cè)定，并將單糖含量換算為淀粉含量；這兩種方法的水解過程操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，不適合于大批量煙草樣品中淀粉含量的測(cè)定。連續(xù)流動(dòng)分析法操作簡(jiǎn)便、快速，目前已成為煙草行業(yè)廣泛應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)方法YC/T 216—2013［9］（簡(jiǎn)稱標(biāo)準(zhǔn)方法）。然而，連續(xù)流動(dòng)分析法的樣品前處理操作步驟仍然較繁瑣，不利于批量樣品的分析。

隨著煙草行業(yè)基因編輯工廠化育種工作的啟動(dòng)，在育種過程中通過基因編輯技術(shù)會(huì)產(chǎn)生數(shù)萬個(gè)素材，現(xiàn)有的分析方法難以滿足這些海量素材的化學(xué)分析和評(píng)價(jià)需求。因此，對(duì)煙草淀粉測(cè)定的樣品前處理方法進(jìn)行了改進(jìn)，通過設(shè)計(jì)一種無需樣品轉(zhuǎn)移即可實(shí)現(xiàn)去除干擾成分、萃取和過濾的樣品萃取瓶并將其作為前處理裝置，建立基于連續(xù)流動(dòng)法快速測(cè)定基因編輯素材中淀粉含量的方法，旨在為大量基因編輯素材淀粉含量的測(cè)定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

烤煙（云南玉溪，C3F 等級(jí)）、白肋煙（湖北恩施、C2F 等級(jí)）、香料煙（云南保山、AB 等級(jí)）；基因編輯素材（分苗期、團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、成熟期4 個(gè)階段采樣）。

本實(shí)驗(yàn)中所用試劑均參照標(biāo)準(zhǔn)方法中所述方案進(jìn)行配制，除特殊說明外，所用試劑均為分析純或以上級(jí)別。

AL204 型電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；KR-934CFS 型超聲波發(fā)生器（東莞市鎧瑞超聲自動(dòng)化科技有限公司）；樣品萃取瓶（本項(xiàng)目組設(shè)計(jì)）；AA3 型連續(xù)流動(dòng)分析儀（德國(guó)Bran+Luebbe 公司），由取樣器、比例泵、滲析器、螺旋管、比色計(jì)（配570 nm 濾光片）等部件組成，管路組成見圖1。

1.2 方法

1.2.1 樣品萃取瓶設(shè)計(jì)

本項(xiàng)目組設(shè)計(jì)了適合于連續(xù)流動(dòng)分析儀的樣品萃取瓶，改進(jìn)的樣品萃取瓶見圖2。該樣品萃取瓶由外套管（圖2a）和帶20 μm 過濾篩板及密封圈的內(nèi)套管（圖2b）組成。萃取瓶外套管的內(nèi)徑為3.0 cm，高度為8.0 cm；內(nèi)套管外徑為2.9 cm，長(zhǎng)度為10.0 cm；密封圈厚度為0.6 mm，其與外套管形成密封。使用前先檢驗(yàn)萃取瓶密封性，以0.13～0.15 MPa（約1.3～1.5 倍大氣壓）下密封圈處不漏液為合格。該樣品萃取瓶可重復(fù)使用，每次使用完畢后清洗干凈并晾干，即可再次使用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

煙草中的淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成，一般認(rèn)為二者的比例為2∶8，在實(shí)際樣品測(cè)定中，標(biāo)準(zhǔn)溶液中直鏈和支鏈淀粉的比例直接影響測(cè)定結(jié)果，因此本研究中采用直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例為2∶8 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作溶液的具體配制參照標(biāo)準(zhǔn)方法［9］。

1.2.3 樣品處理與分析

圖1 淀粉檢測(cè)的流動(dòng)分析儀管路系統(tǒng)Fig.1 Pipelines of continuous flow analyzer for starch detection

圖2 改進(jìn)的連續(xù)流動(dòng)分析儀樣品萃取瓶及操作過程Fig.2 Sample extraction vial and operation process of modified continuous flow analyzer

將成品煙葉樣品于40 ℃下干燥2 h，粉碎并過425 μm（40 目）篩；將新鮮煙葉樣品采樣冷凍干燥24 h，粉碎并過篩。稱取0.25 g 樣品，加入萃取瓶外套管中（圖2a）；將外套管放置于試管架上，加入25 mL 80%乙醇-氯化鈉飽和溶液；依次插入帶有20 μm 過濾篩板的內(nèi)套管（圖2c），將裝有樣品的試管架放置于超聲波發(fā)生器中，于室溫下超聲萃取30 min；萃取結(jié)束后，向下推動(dòng)內(nèi)套管（圖2d），使萃取液通過過濾篩板進(jìn)入內(nèi)套管（含淀粉的樣品殘?jiān)粼谕馓坠苤校瑮壢V液（以去除樣品中的干擾物質(zhì)）；向棄去萃取液的內(nèi)套管中加入10 mL 80%乙醇-氯化鈉飽和溶液，向上拉動(dòng)內(nèi)套管，使80%乙醇-氯化鈉飽和溶液通過篩板進(jìn)入外套管（圖2e）；充分振蕩以洗滌樣品，洗滌完畢后將內(nèi)套管下壓（圖2d），棄去洗滌液。

向棄去洗滌液的內(nèi)套管中加入25 mL 40%（體積分?jǐn)?shù)）高氯酸溶液，將內(nèi)套管向上拉，使高氯酸溶液通過篩板全部進(jìn)入外套管（圖2e），于室溫下超聲萃取10 min；萃取結(jié)束后將內(nèi)套管下壓（圖2d），使淀粉萃取液通過過濾篩板進(jìn)入內(nèi)套管；向內(nèi)套管中加入25 mL 水，混合均勻；將內(nèi)套管中的淀粉萃取液轉(zhuǎn)移至250 mL 容量瓶中，用水定容至刻度；將定容后的樣品溶液轉(zhuǎn)移至連續(xù)流動(dòng)分析儀的進(jìn)樣杯中，根據(jù)淀粉在酸性條件下與碘發(fā)生顯色反應(yīng)的原理，于570 nm 下進(jìn)行比色測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 新型樣品前處理裝置的設(shè)計(jì)

標(biāo)準(zhǔn)方法中采用砂芯漏斗進(jìn)行樣品過濾前處理操作：將待測(cè)樣品置于砂芯漏斗中，加入80%乙醇-氯化鈉飽和溶液；超聲萃取除去雜質(zhì)后再用40%高氯酸萃取樣品；將萃取液按照1∶10 稀釋后進(jìn)行測(cè)定。在整個(gè)前處理過程中，需將砂芯漏斗置于裝有400 mL 水的燒杯中，除雜、洗滌、萃取淀粉過程中均需取出漏斗逐個(gè)用加壓球加壓過濾，前處理操作繁瑣、耗時(shí)；即使是使用大型的超聲波發(fā)生器一次也只能擺放10 個(gè)裝有400 mL 水的燒杯，即每個(gè)批次最多只能處理10 個(gè)樣品；整個(gè)前處理過程中樣品均在漏斗中，過濾、除雜時(shí)濾孔易被堵塞，導(dǎo)致過濾速度較慢。

為進(jìn)一步簡(jiǎn)化樣品前處理操作，本研究中設(shè)計(jì)了圖2 所示的樣品萃取瓶。該樣品萃取瓶的外套管可以實(shí)現(xiàn)樣品裝載和萃取的功能，內(nèi)套管可以實(shí)現(xiàn)樣品免轉(zhuǎn)移過濾的功能。采用本裝置，在整個(gè)樣品前處理操作過程中不需要轉(zhuǎn)移樣品，因而樣品前處理過程得到了明顯簡(jiǎn)化；另外，超聲萃取前用內(nèi)套管卡住樣品外套管的口部，避免了超聲萃取過程中可能出現(xiàn)的萃取液濺出或被污染的風(fēng)險(xiǎn)。采用該樣品萃取瓶不僅可以集樣品超聲萃取、萃取液過濾、廢液轉(zhuǎn)移于一體，而且可以進(jìn)行大批量樣品前處理操作。此外，使用該樣品萃取瓶進(jìn)行樣品前處理時(shí)，可以有效地避免過濾過程中的篩板堵塞，因而過濾速度較快。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

由于煙草中有多酚、色素、醌類等成分，會(huì)干擾淀粉的測(cè)定，因此標(biāo)準(zhǔn)方法中采用80%乙醇-氯化鈉飽和溶液超聲萃取30 min［9］以除去樣品中的干擾雜質(zhì)，而雷諾公司采用75%甲醇-氯化鈉飽和溶液72 ℃萃取30 min［15］的方法。由于標(biāo)準(zhǔn)方法無需加熱，操作更簡(jiǎn)便，因此本研究中參考標(biāo)準(zhǔn)方法，選擇在室溫下對(duì)樣品進(jìn)行超聲萃取以脫除雜質(zhì)。稱取7 份烤煙試樣，各加入25 mL 80%乙醇-氯化鈉飽和溶液，依次超聲5、l0、20、30、40、50 和60 min，以不超聲萃取脫除雜質(zhì)（0 min）為對(duì)照，樣品中的淀粉含量檢測(cè)結(jié)果見圖3?？梢钥闯觯?0 min 后，樣品中淀粉含量基本保持不變，表明樣品中的干擾物質(zhì)已基本去除。為確保雜質(zhì)完全被去除，本研究中選擇超聲萃取時(shí)間為30 min。

圖3 超聲萃取去除雜質(zhì)時(shí)間對(duì)淀粉含量的影響Fig.3 Influences of impurity removing time in ultrasonic extraction on starch content

除去樣品中干擾淀粉測(cè)定的雜質(zhì)后，需用高氯酸萃取樣品中的淀粉。雷諾公司采用40%高氯酸在室溫下靜置萃取樣品中的淀粉［7］，而標(biāo)準(zhǔn)方法中采用40%高氯酸超聲萃取煙草中的淀粉［15］，兩種方法的萃取時(shí)間均為10 min。本研究中比較了靜置萃取、振蕩萃取和超聲萃取等方法對(duì)淀粉的萃取效率，以典型的烤煙樣品為例，分別在室溫下靜置萃取、振蕩萃取和超聲萃取10 min，淀粉含量檢測(cè)結(jié)果見表1。可以看出，超聲萃取法的效果略好于靜置萃取和振蕩萃取法，這可能是因?yàn)槌曒腿「资沟矸叟c小分子化合物通過氫鍵作用相結(jié)合，并發(fā)生溶脹，從而使淀粉更容易轉(zhuǎn)移到萃取液中。因此，選擇使用40%高氯酸超聲萃取10 min 的方法。

表1 不同萃取方式對(duì)淀粉測(cè)定結(jié)果的影響Tab.1 Influences of different extraction methods on starch content

2.3 工作曲線

對(duì)配制的不同質(zhì)量濃度的淀粉系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行檢測(cè)分析，并以淀粉的峰高對(duì)其濃度進(jìn)行線性回歸，得到淀粉的工作曲線。實(shí)驗(yàn)中得到的線性回歸方程為Y = 867.4X + 69.58，相關(guān)系數(shù)r = 0.999 6。該工作曲線能覆蓋本研究中所有類型煙草樣品的淀粉含量范圍。

2.4 回收率

分別稱取0.250 6 g 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品（99.8%）和1.002 5 g 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品（99.8%）于燒杯中；向直鏈淀粉的燒杯中加入2.0 g 氫氧化鈉，用水煮沸溶解，而支鏈淀粉直接用水煮沸溶解；冷卻后分別轉(zhuǎn)入50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，得到回收率實(shí)驗(yàn)用淀粉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，其中，直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度為5.002 mg/mL，支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度為20.010 mg/mL；分別移取直鏈淀粉儲(chǔ)備液和支鏈淀粉儲(chǔ)備液各10 mL 于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，得到回收率實(shí)驗(yàn)用淀粉混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（淀粉混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度為5.002 4 mg/mL）。

選擇典型的烤煙、白肋煙和香料煙樣品進(jìn)行3個(gè)不同濃度的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。在3 組（每組3 個(gè)樣品）已加入相同煙草樣品的外套管中分別加入不同量的淀粉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，見表2。實(shí)驗(yàn)中，加標(biāo)量均覆蓋樣品可能的含量范圍。用冷凍干燥機(jī)除去加標(biāo)后的樣品中的水分，然后進(jìn)行前處理和檢測(cè)。由表2 可以看出，方法回收率為96.40%～101.30%，表明本方法較準(zhǔn)確。

表2 方法回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Recovery of the method

2.5 精密度

選擇白肋煙、香料煙和烤煙樣品，在同一天內(nèi)平行測(cè)定7 次，計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）；相同樣品每天測(cè)定1 次，連續(xù)測(cè)定7 d，計(jì)算日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明：烤煙樣品（淀粉含量3.86%），日內(nèi)RSD 為0.96%，日間RSD 為1.24%；白肋煙樣品（淀粉含量0.84%），日內(nèi)RSD 為2.48%，日間RSD 為3.22%；香料煙樣品（淀粉含量2.28%），日內(nèi)RSD 為1.87%，日間RSD 為2.32%?？梢姡痉椒ǖ脑佻F(xiàn)性較好。

2.6 實(shí)際樣品分析結(jié)果

采用本方法和標(biāo)準(zhǔn)方法分析云南中煙T0 代基因編輯素材苗期、團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、成熟期4 個(gè)階段的淀粉含量，結(jié)果見表3。對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t 檢驗(yàn)，結(jié)果P 值為0.712（＞0.05），說明兩種方法的測(cè)定值無顯著差異。

表3 顯示，不同成長(zhǎng)階段的煙株中淀粉含量不同：苗期淀粉含量較低；團(tuán)棵期淀粉含量較苗期明顯增加；旺長(zhǎng)期與團(tuán)棵期相比淀粉含量沒有明顯變化；成熟期淀粉含量顯著高于前3 個(gè)生長(zhǎng)階段。淀粉含量的變化與煙株不同生長(zhǎng)階段的特性有關(guān)。在苗期，煙株葉面積較小，光合能力較弱，淀粉類光合產(chǎn)物主要滿足煙株生長(zhǎng)發(fā)育的需要。在團(tuán)棵期，葉面積增大，光合作用增強(qiáng)，合成的淀粉類產(chǎn)物較多，這些物質(zhì)除了可以滿足煙株生長(zhǎng)發(fā)育的需求外，還開始在煙葉中累積?？傮w上，在煙株生長(zhǎng)前期，煙葉光合作用產(chǎn)物主要滿足新器官、新組織的形成和生長(zhǎng)需要，淀粉等碳水化合物的含量呈緩慢增加的趨勢(shì)。在旺長(zhǎng)期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要供給煙株的生殖生長(zhǎng)，淀粉累積速度減緩。在成熟期，煙葉中可溶性總糖和還原糖急劇升高，為淀粉的合成提供了更多碳源，導(dǎo)致淀粉大量累積［16-18］。

表3 本方法與YC/T 216—2013 方法檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比Tab.3 Comparison of determination results between the proposed method and the method described in YC/T 216—2013 （%）

3 結(jié)論

在標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一種新型樣品萃取瓶，采用該樣品萃取瓶，不需要樣品轉(zhuǎn)移操作即可完成樣品的脫除雜質(zhì)、洗滌和淀粉萃??；而且多個(gè)樣品可放在試管架上進(jìn)行批量處理。與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，本方法的樣品前處理步驟簡(jiǎn)單，樣品檢測(cè)效率得到了顯著提高。3 個(gè)不同添加水平下的回收率為96.40%～101.30%；日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.3%。采用本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法YC/T 216—2013 的樣品測(cè)定結(jié)果無明顯差異。本方法為煙草基因編輯素材的淀粉分析提供了一種快速、準(zhǔn)確、可靠的高通量方法。