郭 澤，李子紳，代曉燕，王英鋒

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院/煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002）

鉀是植物細(xì)胞中含量最豐富的陽(yáng)離子之一[1]，約占植物干重的2%～10%[2]。鉀元素參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多過(guò)程[3]。雖然土壤中鉀離子濃度一般在0.025～5 mmol/L范圍內(nèi)[4]，但植物根際中的鉀離子濃度常低于0.3 mmol/L[5]，所以大田農(nóng)作物經(jīng)常處于缺鉀狀態(tài)。而植物根系是對(duì)缺鉀信號(hào)最敏感的原初器官，植物對(duì)鉀素的吸收主要取決于其根系。因此，研究低鉀脅迫下植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育及吸鉀狀況，對(duì)提高植物體內(nèi)鉀素水平具有重要意義。對(duì)擬南芥低鉀脅迫下鉀離子信號(hào)傳導(dǎo)途徑研究表明：第一，低鉀脅迫可引起H+-ATPase活性的提高，導(dǎo)致質(zhì)膜的超極化和細(xì)胞外酸化，前者可激活內(nèi)流型鉀離子通道AKT1和可滲透性鈣離子通道，后者可促進(jìn)HAK5類鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控的鉀吸收；第二，低鉀可誘導(dǎo)根細(xì)胞中活性氧的累積，最終調(diào)控HAK5類鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)錄變化[6-7]和激活A(yù)KT1等鉀離子通道的活性，從而調(diào)控鉀離子的吸收[8]。進(jìn)一步的研究表明，低鉀脅迫下，植物根系的生長(zhǎng)會(huì)發(fā)生變化，這是由于低鉀脅迫可誘導(dǎo)乙烯的產(chǎn)生，促進(jìn)中柱生長(zhǎng)素運(yùn)輸基因PIN3和PIN7的轉(zhuǎn)錄量增加，從而影響生長(zhǎng)素在植株根系中的分布[9]。乙烯也可促進(jìn)生長(zhǎng)素從根尖到分生區(qū)的運(yùn)輸量，大量積累的生長(zhǎng)素抑制了植物主根的生長(zhǎng)，說(shuō)明低鉀脅迫可刺激植物激素生長(zhǎng)素的合成進(jìn)而影響植物根系形成，也說(shuō)明生長(zhǎng)素是低鉀脅迫信號(hào)傳導(dǎo)的主要因素和植物根系對(duì)鉀素吸收運(yùn)輸?shù)闹匾镔|(zhì)。對(duì)于生長(zhǎng)素影響鉀素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的研究集中在頂端調(diào)控的情況下，如郭麗琢等[10]研究發(fā)現(xiàn)，煙株打頂后用NAA處理莖斷口，煙株及煙葉內(nèi)K的最終積累量增加。洪麗芳等[11]利用86Rb標(biāo)記示蹤原子法研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)煙草施用生長(zhǎng)素以后，86Rb在木質(zhì)部中的運(yùn)輸量增強(qiáng)，在韌皮部中下運(yùn)的量降低，因此有利于鉀素在煙葉中的積累。進(jìn)一步對(duì)鉀離子通道與植物激素類物質(zhì)的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，打頂抑制了鉀離子通道基因在煙葉中的表達(dá)，誘導(dǎo)其在根中的表達(dá)，且打頂后在植物頂端涂抹生長(zhǎng)素類物質(zhì)，可抑制因打頂引起的鉀離子通道基因在煙葉和根系中的表達(dá)[12]。這說(shuō)明打頂后涂抹生長(zhǎng)素可能通過(guò)引起植物體內(nèi)相關(guān)鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而影響植物對(duì)鉀素的吸收。目前對(duì)于生長(zhǎng)素與鉀素吸收積累與轉(zhuǎn)錄分析的調(diào)控研究都是在頂端調(diào)控下進(jìn)行的，而對(duì)于植物吸收鉀離子的主要部位根系的調(diào)控研究較少，且對(duì)生長(zhǎng)素參與調(diào)控?zé)熤旮碘涬x子的吸收和運(yùn)輸機(jī)制并不清楚。本文以模式植物煙草為研究材料，采用室內(nèi)水培的方法，通過(guò)對(duì)煙株根系進(jìn)行不同濃度的鉀素及外源生長(zhǎng)素處理，探索生長(zhǎng)素參與調(diào)控?zé)煵莞档奈洐C(jī)理，以期為理解低鉀脅迫下植物的吸鉀機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 供試材料與材料培養(yǎng)

供試材料為煙草品種‘豫煙6號(hào)’，試驗(yàn)在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。煙草種子完成催芽后，均勻移栽在裝有Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液和珍珠巖的黑色小盆容器中，然后放置在光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件：晝溫 (28 ± 2)℃，夜溫(18 ± 2)℃，光周期14 h，光照強(qiáng)度4000 lx，相對(duì)濕度65%～70%。

1.2 試驗(yàn)處理

當(dāng)煙苗長(zhǎng)至3片真葉時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗，用去離子水洗凈根系后移至水培盒子進(jìn)行水培處理。首先放入無(wú)鉀的Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行鉀饑餓48 h，再分別置于不同的鉀水平營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)鉀水平，分別為正常供鉀 (5 mmol/L)和低鉀 (0.15 mmol/L)[13]，培養(yǎng)期間用通氣泵間歇通氣。為保持營(yíng)養(yǎng)液中的養(yǎng)分濃度相對(duì)穩(wěn)定，每隔4 天換一次營(yíng)養(yǎng)液。營(yíng)養(yǎng)液除鉀水平不同外，其它成分含量均按照Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液方法進(jìn)行。鉀處理8天后同時(shí)添加不同濃度的外源生長(zhǎng)素進(jìn)行處理，外源生長(zhǎng)素為3-吲哚乙酸，共設(shè)5個(gè)濃度：0、5、10、20、40 μmol/L (前期進(jìn)行大量探索試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素濃度過(guò)高時(shí)，根系生長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)直接壞死，因此，本文生長(zhǎng)素濃度的設(shè)置為前期試驗(yàn)篩選所得)。生長(zhǎng)素使用時(shí)用無(wú)水乙醇按50 mg/mL的比例進(jìn)行溶解。處理4 d后取樣測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)，每個(gè)處理6次重復(fù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 根系及地上部干重 分別取植株根系及地上部，在105℃烘箱中殺青30 min后，65℃中烘干至恒重，分別測(cè)定根系及地上部干重。

1.3.2 根系掃描特征 待處理時(shí)間結(jié)束后，迅速剪取煙草完整根系，通過(guò)數(shù)字化掃描儀 (EPSON Expreeion 1000XL) 對(duì)根系進(jìn)行掃描，之后用WinRHIZO根系分析系統(tǒng)軟件對(duì)根系八項(xiàng)指標(biāo) (總根長(zhǎng)、根體積、根總表面積、根投影面積、根平均直徑、根尖數(shù)、根分叉數(shù)和根交疊數(shù)) 進(jìn)行定量分析。

1.3.3 根系生理指標(biāo) 根系活力測(cè)定采用TTC (氯化三苯基四氮唑) 法[14]；根系H+-ATPase活性根據(jù)試劑盒使用步驟進(jìn)行測(cè)定[15](試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所)；根系可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法[16]測(cè)定。

1.3.4 植株各部位生長(zhǎng)素濃度 分別采集主根尖(0～2 cm)、側(cè)根尖 (0～2 cm) 和頂部第一片功能葉片0.5 g新鮮煙草樣品，用液氮速凍后，存放于-80℃冰箱中保存，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)[17](酶免疫試劑盒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)化控中心提供) 進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 植株各部位鉀素濃度 精確稱取烘干磨碎過(guò)0.2 mm篩的樣品0.1000 g左右，采用1 mmol/L鹽酸-火焰光度計(jì)法[18]，測(cè)定植株根系及地上部鉀含量。

1.3.6 根系鉀吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù) 參照Xu等[8]的溶液耗竭方法進(jìn)行試驗(yàn)。取供試煙苗在無(wú)鉀營(yíng)養(yǎng)液中饑餓處理2天，期間每天換饑餓液1次。耗竭試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將煙苗裝入含50 mL耗竭液的黑色三角瓶中(耗竭液由 0.4 mmol/L KNO3、0.2 mmol/L CaSO4組成)，每隔12 h取樣一次，直到耗竭液中鉀濃度接近零時(shí)結(jié)束取樣。每次取10 mL耗竭液，取樣后用10 mL去離子水補(bǔ)充。用火焰光度計(jì)測(cè)定耗竭液鉀濃度。以耗竭液的鉀濃度為縱坐標(biāo)，耗竭時(shí)間為橫坐標(biāo)作鉀離子耗竭曲線，得出一元二次方程模型Y=a+bX+cX2，其中X代表吸收時(shí)間，Y代表該時(shí)刻耗竭液中鉀濃度。

結(jié)合Li和Ma的方法[19]，計(jì)算根系鉀吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax = [b× 耗竭液體積 (mL)]/[0.06 × 鮮根重(g)]，Km =a- 3b2/16c，Cmin=a-b2/4c，其中a、b、c不考慮正負(fù)號(hào)。

1.3.7 鉀離子相關(guān)通道基因表達(dá)量 鉀離子通道相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定：采用trizol法提取總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計(jì) (Thermo Scientific，USA) 測(cè)定濃度及OD260/OD280，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。利用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+ gDNA wiper) (Vazyme，R223-01) 將待測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物采用Roche LCPDS2軟件設(shè)計(jì)并由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如表1。內(nèi)參基因?yàn)闊煵軦CTIN基因。利用QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit試劑盒 (Qiagen，Germany)在LightCycler?480 Ⅱ型熒光定量 PCR 儀 (Roche，Swiss)上進(jìn)行反應(yīng)。體系：2 × QuantiFast?SYBR?Green PCR Master Mix，5 μL；10 μmol/L Forward primer，0.2 μL；10μmol/L Reverse primer，0.2 μL；cDNA，1 μL；Nuclease-free H2O，3.6 μL。PCR 程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測(cè)產(chǎn)物特異性：從60℃緩慢升溫至97℃，每℃采集5次熒光信號(hào)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 煙草鉀離子通道相關(guān)基因引物序列Table 1 Tobacco potassium channel related gene primer sequence

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，SPSS21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)素參與不同鉀水平下對(duì)植株根系生長(zhǎng)的影響

圖1 供鉀5 mmol/L和0.15 mmol/L水平下外源生長(zhǎng)素處理煙草根系及地上部干物質(zhì)重Fig. 1 Root and aboveground dry matter weight of tobacco plant as affected by different exogenous auxin concentrations under treatments of K 5 and 0.15 mmol/L

2.1.1 植株根系及地上部干物質(zhì)重 如圖1所示，正常供鉀水平下植株根系和地上部干物質(zhì)累積量整體高于低鉀水平，其中在生長(zhǎng)素濃度為0 μmol/L時(shí)，地上部干重差異顯著。添加生長(zhǎng)素以后，無(wú)論正常供鉀或是低鉀條件下，隨著外源生長(zhǎng)素濃度的增加，根系和地上部干重均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且均在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值，其中地上部干重在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)與其余處理差異達(dá)到顯著水平 (P〈 0.05)。

2.1.2 植株根系掃描特征 由表2可知，正常供鉀水平下各項(xiàng)指標(biāo) (總根長(zhǎng)、根總體積、根總表面積、根投影面積、根平均直徑、根尖數(shù)、根分叉數(shù)、根交疊數(shù)) 數(shù)值均明顯高于低鉀水平相應(yīng)處理，且大部分差異達(dá)到顯著水平 (P〈 0.05)，其中在生長(zhǎng)素濃度為0 μmol/L的條件下，正常供鉀植株根尖數(shù)高達(dá)低鉀植株的4.38倍；在生長(zhǎng)素濃度為5 μmol/L的條件下，正常供鉀植株根系總長(zhǎng)度高達(dá)低鉀植株的2.38倍，根系總體積可達(dá)低鉀植株的2.91倍，說(shuō)明低鉀脅迫顯著影響植株根系的生長(zhǎng)發(fā)育。在正常供鉀條件下，各項(xiàng)根系指標(biāo)隨著外源生長(zhǎng)素濃度的增加變化規(guī)律表現(xiàn)不一致，且趨勢(shì)不明顯。但在低鉀條件下，根系的總長(zhǎng)度和根尖數(shù)均表現(xiàn)出隨著外源生長(zhǎng)素濃度的增加先增加后降低的趨勢(shì)，且均在外源添加生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到最高且與其余處理相比差異達(dá)到顯著水平 (P〈 0.05)，根平均直徑的變化規(guī)律與其正好相反，其他幾項(xiàng)指標(biāo)變化規(guī)律呈波浪線趨勢(shì)。

表2 供鉀5 mmol/L和0.15 mmol/L水平下外源生長(zhǎng)素處理的煙草植株根系掃描特征Table 2 Root scanning characteristics of exogenous auxin treated tobacco plants under treatments of K 5 and 0.15 mmol/L

2.1.3 植株根系生理特征 如圖2-a所示，未添加生長(zhǎng)素時(shí)，正常供鉀與低鉀植株根系活力差異不顯著。添加生長(zhǎng)素以后，在常鉀條件下，隨著外源生長(zhǎng)素濃度的增加，根系活力呈先減少后增加又減少再增加的波浪型趨勢(shì)。低鉀情況下，根系活力隨著所添加生長(zhǎng)素濃度的增加呈先增加后降低的單峰變化趨勢(shì)，其中在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到最大，且為不添加生長(zhǎng)素處理的3.3倍，與低鉀其他處理差異達(dá)到顯著水平 (P〈 0.05)。

如圖2-b所示，在未添加外源生長(zhǎng)素的情況下，常鉀植株ATPase活性顯著高于低鉀處理，說(shuō)明低鉀脅迫可降低植株根系質(zhì)膜ATPase的活性。添加外源生長(zhǎng)素以后，低鉀水平植株ATPase活性整體高于正常供鉀水平，且隨著生長(zhǎng)素濃度升高，正常供鉀條件煙株根系A(chǔ)TPase活性表現(xiàn)為先降低后增加后又降低的波浪型趨勢(shì)；低鉀條件下根系A(chǔ)TPase活性表現(xiàn)為先增加后降低的單峰型趨勢(shì)，在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到峰值，為不添加生長(zhǎng)素處理的1.89倍，且與低鉀其余處理間差異達(dá)到顯著水平 (P〈 0.05)。

由圖2-c可知，除了外源生長(zhǎng)素濃度為40 μmol/L時(shí)，其他生長(zhǎng)素濃度條件下，低鉀水平可溶性蛋白含量均高于常規(guī)鉀水平處理，說(shuō)明低鉀脅迫仍可刺激根系的代謝活動(dòng)。無(wú)論正常供鉀或是低鉀條件下，隨著外源生長(zhǎng)素濃度的增加，植株根系中可溶性蛋白含量都呈現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)，其中常鉀植株在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)可溶性蛋白含量達(dá)到最大值，低鉀植株在生長(zhǎng)素濃度為5 μmol/L可溶性蛋白含量達(dá)到最大值，且與低鉀其他處理相比差異達(dá)到顯著水平 (P〈 0.05)。

圖2 供鉀5 mmol/L和0.15 mmol/L水平下外源生長(zhǎng)素處理煙草根系生理特征Fig. 2 Physiological characteristics of roots of exogenous auxin treated tobacco plants under treatments of K 5 and 0.15 mmol/L

2.1.4 植株各部位內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度分布特征 如圖3-a所示，在主根尖內(nèi)源生長(zhǎng)素中，除了外源生長(zhǎng)素濃度為20 μmol/L外，其他4個(gè)外源生長(zhǎng)素濃度條件下，低鉀水平根尖內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度均高于正常供鉀水平。無(wú)論正常供鉀或是低鉀條件下，隨著外源生長(zhǎng)素濃度的增加，主根尖內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度整體呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，且均在外源生長(zhǎng)素濃度為40 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值28.39和20.57 ng/g, FW。

由圖3-b可知，在側(cè)根尖內(nèi)源生長(zhǎng)素中，添加不同濃度的外源生長(zhǎng)素后，低鉀水平側(cè)根尖內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度均高于正常供鉀水平。無(wú)論正常供鉀或是低鉀水平，添加生長(zhǎng)素以后，側(cè)根尖內(nèi)源生長(zhǎng)素均表現(xiàn)出增加趨勢(shì)，其中在生長(zhǎng)素濃度為0～20 μmol/L時(shí)變化不大，在生長(zhǎng)素濃度為20～40 μmol/L時(shí)內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度迅速增加達(dá)到最大值且與其余處理間差異達(dá)到顯著水平 (P〈 0.05)。

圖3 供鉀5 mmol/L和0.15 mmol/L水平下外源生長(zhǎng)素處理植株各部位內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度Fig. 3 Endogenous auxin concentration in various parts of exogenous auxin-treated tobacco plants under treatments of K 5 and 0.15 mmol/L

由圖3-c可知，在葉片內(nèi)源生長(zhǎng)素中，低鉀水平下葉片內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度整體均高于正常供鉀水平。正常供鉀水平下，隨著外源生長(zhǎng)素濃度的增加，葉內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度表現(xiàn)為先降低后增加又降低的規(guī)律；低鉀水平下，在外源生長(zhǎng)素濃度為0～10 μmol/L時(shí)，葉內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)最低，為35.88 ng/g, FW，之后隨著外源生長(zhǎng)素濃度的升高，葉片內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度開(kāi)始升高。

2.2 不同鉀水平下生長(zhǎng)素對(duì)植株體內(nèi)鉀素吸收的影響

2.2.1 植株各部位鉀素濃度 由表3可知，鉀水平、生長(zhǎng)素濃度以及兩者互作3個(gè)因素均對(duì)植株各部位鉀素濃度有顯著影響，對(duì)鉀素的貢獻(xiàn)率分別達(dá)到了83.9%、3.50%、12.5%，說(shuō)明鉀水平對(duì)植株各部位鉀素濃度起著關(guān)鍵作用，其次是兩者互作，最后是生長(zhǎng)素濃度。

表3 鉀水平和生長(zhǎng)素濃度對(duì)植株各部位鉀素濃度影響的方差分析Table 3 Variance analysis of potassium level and auxin concentration on potassium concentration in various parts of plants

如圖4所示，無(wú)論是在根系還是葉片中，正常供鉀條件下其鉀素濃度均顯著高于低鉀水平 (P〈 0.05)。在根系中，隨著生長(zhǎng)素濃度的增加，正常供鉀植株根系鉀素濃度表現(xiàn)為持續(xù)降低趨勢(shì)；低鉀植株根系鉀素濃度表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)，其中在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值14.21 mg/g且與其他處理差異達(dá)到顯著水平。在葉片中，正常供鉀條件下，當(dāng)生長(zhǎng)素濃度為0～10 μmol/L時(shí)，其鉀素濃度變化不大，在生長(zhǎng)素濃度為10～20 μmol/L時(shí)，其鉀素濃度迅速降低，之后隨著生長(zhǎng)素濃度的增加，其鉀素濃度又緩慢升高；而低鉀植株葉片鉀素濃度表現(xiàn)為先緩慢升高又緩慢降低的趨勢(shì)，其中在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到峰值38.7 mg/g。

圖4 供鉀5 mmol/L和0.15 mmol/L水平下外源生長(zhǎng)素處理植株根系和葉片鉀濃度Fig. 4 Potassium concentration in various parts of plants treated with exogenous auxin under treatments of K 5 and 0.15 mmol/L

2.2.2 植株根系鉀吸收動(dòng)力學(xué)特征差異 根系鉀吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax和Km用來(lái)定量表征根系吸鉀特征，Vmax表示植物對(duì)鉀離子的最大吸收速率，其值越大，表示植株對(duì)鉀離子的吸收能力越強(qiáng)[20]；Km表示植株對(duì)鉀離子的親和力，其值越大，親和力越低[21]。在測(cè)定各部位鉀素濃度的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了煙株根系對(duì)鉀素吸收的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明 (表4)，正常供鉀水平下根系動(dòng)力學(xué)參數(shù)值均明顯高于低鉀水平。隨著生長(zhǎng)素濃度的升高，正常供鉀和低鉀條件下根系Vmax均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，其中正常供鉀在生長(zhǎng)素濃度為5 μmol/L時(shí)達(dá)到峰值，為不添加生長(zhǎng)素處理的2.26倍，低鉀在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到峰值，為不添加生長(zhǎng)素處理的1.94倍，且差異達(dá)到顯著水平 (P〈 0.05)；Km在正常供鉀時(shí)表現(xiàn)為持續(xù)降低趨勢(shì)，在低鉀時(shí)表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì)，在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到最小值。

表4 植株根系鉀吸收動(dòng)力學(xué)特征差異Table 4 Difference of kinetics of potassium absorption in plant root

2.2.3 植株體內(nèi)相關(guān)鉀離子通道基因表達(dá)量檢測(cè)從圖5-a, b可知，NKT2基因在植株根系中的表達(dá)量整體高于葉片，且低鉀水平下NKT2基因的表達(dá)量普遍高于正常供鉀水平，隨著生長(zhǎng)素濃度的提高，根系和葉片中基因NKT2的表達(dá)量整體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在根系中，正常供鉀和低鉀條件下，NKT2基因的表達(dá)量均在外源生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到峰值，其中此時(shí)低鉀條件下NKT2基因的表達(dá)量相對(duì)于低鉀無(wú)添加生長(zhǎng)素增加了6.83倍，顯著高于其他各處理。葉片中，正常供鉀條件下NKT2基因的表達(dá)量在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值；低鉀條件下在生長(zhǎng)素濃度為5 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值，且顯著高于其余各處理 (P〈 0.05)。

從圖5-c, d可知，隨著生長(zhǎng)素濃度的增加，根系和葉片中NtKC1基因的表達(dá)量整體表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)。在根系中，正常供鉀水平下各處理NtKC1基因的表達(dá)量均高于相應(yīng)低鉀水平；相對(duì)于正常供鉀無(wú)添加生長(zhǎng)素處理，低鉀水平下各處理該基因的表達(dá)量均降低。正常供鉀條件下，NtKC1基因的表達(dá)量在生長(zhǎng)素濃度為20 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值；低鉀條件下在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)其值最高。在葉片中，正常供鉀條件下，在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)NtKC1基因的表達(dá)量與無(wú)添加生長(zhǎng)素時(shí)水平相當(dāng)，生長(zhǎng)素濃度為20 μmol/L時(shí)NtKC1基因表達(dá)量最高；低鉀條件下，NtKC1表達(dá)量在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值。

Ntork1屬于外流型鉀離子通道基因。從圖5-e,f可知，無(wú)論是根系還是葉片，正常供鉀水平下各處理Ntork1基因的表達(dá)量均高于低鉀水平各相應(yīng)處理，且相對(duì)于正常供鉀無(wú)添加生長(zhǎng)素處理，低鉀水平下植株Ntork1基因的表達(dá)量均降低；隨著生長(zhǎng)素濃度的升高，根系和葉片中Ntork1基因的表達(dá)量整體呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，且無(wú)論正常供鉀或是低鉀，該基因的表達(dá)量均在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到最低值同時(shí)差異達(dá)到顯著性 (P〈 0.05)。

3 討論

3.1 外源生長(zhǎng)素對(duì)不同鉀水平下植株根系生長(zhǎng)及各部位內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度的影響

根系是植物吸收礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的主要部位，研究表明，外界供鉀水平的高低顯著影響煙株根系及地上部生長(zhǎng)發(fā)育和干物質(zhì)累積。在正常供鉀水平下各組織干物質(zhì)累積量高于低鉀水平，說(shuō)明低鉀脅迫影響干物質(zhì)在植株中的累積，不利于根系的發(fā)育，這與代曉燕等[22-23]的研究結(jié)果一致。洪麗芳等[11]、代曉燕等[24]、劉世亮等[25]研究表明，打頂后葉面外施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或生長(zhǎng)素類物質(zhì)可增加煙葉干物質(zhì)累積量，這與本試驗(yàn)中不同供鉀水平下添加外源生長(zhǎng)素改善煙株生長(zhǎng)狀況的結(jié)果相一致。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在正常供鉀和低鉀條件下，當(dāng)添加外源生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)，可明顯提高煙株根系及地上部干物質(zhì)重，改善煙株生長(zhǎng)發(fā)育狀況。這說(shuō)明通過(guò)根系添加生長(zhǎng)素類物質(zhì)也可調(diào)控植株根系生長(zhǎng)，與以前研究發(fā)現(xiàn)打頂時(shí)葉面外施生長(zhǎng)素的作用一致。

植物根系結(jié)構(gòu)的可塑性 (尤其是側(cè)根) 是植物進(jìn)化過(guò)程中對(duì)根際環(huán)境脅迫的一種適應(yīng)機(jī)制。植物在面臨各種根際環(huán)境時(shí)會(huì)持續(xù)地改變其根系構(gòu)型，主要是側(cè)根的數(shù)量和長(zhǎng)度。Dubrovsky等[26]發(fā)現(xiàn)當(dāng)擬南芥根系維管柱細(xì)胞生長(zhǎng)素濃度降低時(shí)，擬南芥?zhèn)雀拿劝l(fā)和伸長(zhǎng)都受到抑制。研究表明，擬南芥在低鉀脅迫下，根系的生長(zhǎng)會(huì)發(fā)生變化，而這與低鉀脅迫下植物激素的變化有關(guān)，根系中大量累積的生長(zhǎng)素抑制植物主根生長(zhǎng)[9]，這與本試驗(yàn)中低鉀脅迫條件下根系的發(fā)育狀況一致，WinRHIZO軟件分析也表明正常供鉀水平各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)值均顯著高于低鉀水平處理，說(shuō)明低鉀脅迫在一定程度上抑制了根系的伸長(zhǎng)，不利于根系的生長(zhǎng)發(fā)育。但是其中在外源生長(zhǎng)素濃度為20 μmol/L時(shí)，正常供鉀與低鉀條件下植株根系各項(xiàng)掃描指標(biāo)與根系干重表現(xiàn)出相矛盾的關(guān)系，研究認(rèn)為這種情況可能是由于低鉀條件下，添加特定濃度的生長(zhǎng)素可能會(huì)影響植株內(nèi)部某種機(jī)制，從而對(duì)低鉀植株的干物質(zhì)累積量及含水率有影響，雖然根系掃描各指標(biāo)值較低，但其干物質(zhì)積累量卻不少。對(duì)于這種特殊情況也是以后工作中我們需要繼續(xù)探討和有待于證實(shí)的問(wèn)題。在低鉀條件下，施加生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)根系的長(zhǎng)度、根尖數(shù)和根交疊數(shù)達(dá)到峰值，說(shuō)明外施一定濃度的生長(zhǎng)素濃度能夠緩解低鉀脅迫，有利于根系伸長(zhǎng)，并增加側(cè)根數(shù)量，增大根系體積和吸收面積。

圖5 供鉀5和0.15 mmol/L水平下外源生長(zhǎng)素處理的煙草植株鉀離子通道基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 Relative expression levels of potassium channel genes in exogenous auxin-treated tobacco plants under treatments of K 5 and 0.15 mmol/L

根系活力表征根系的代謝狀況，是反映根系吸收營(yíng)養(yǎng)元素和水分的重要指標(biāo)，根系活力愈強(qiáng)，代表根系吸收能力越強(qiáng)，提供給植株地上部的養(yǎng)分和水分也越多[27]。本試驗(yàn)研究證明，在不添加生長(zhǎng)素時(shí)，正常供鉀植株根系活力值高于低鉀植株。低鉀水平下，通過(guò)添加適當(dāng)濃度的生長(zhǎng)素可提高根系活力，提高根系的鉀素吸收能力。根系A(chǔ)TP酶的活性影響質(zhì)子跨膜運(yùn)輸，進(jìn)而影響植株根系對(duì)礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收，是表示根系代謝強(qiáng)度的重要指標(biāo)[28]。楊鐵釗等[15]研究表明，低鉀脅迫條件下可降低植株根系A(chǔ)TP酶的活性，不利于質(zhì)子跨膜運(yùn)輸，對(duì)養(yǎng)分的吸收產(chǎn)生阻礙作用，本試驗(yàn)結(jié)果與其一致，在低鉀條件下，根系A(chǔ)TP酶的活性顯著低于正常供鉀水平 (P〈0.05)。但是，在添加不同濃度的外源生長(zhǎng)素以后，低鉀根系A(chǔ)TP酶的活性反而高于相應(yīng)正常供鉀水平，且在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)酶活性最高，說(shuō)明在低鉀條件下可通過(guò)適當(dāng)添加外源生長(zhǎng)素來(lái)改善根系A(chǔ)TP酶的活性，進(jìn)而調(diào)控植物根系對(duì)礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收。根系可溶性蛋白主要由根系中的酶組成，可溶性蛋白含量增加是根系活性增強(qiáng)的基礎(chǔ)。從根系可溶性蛋白含量上來(lái)看，低鉀條件下可溶性蛋白含量整體高于常規(guī)供鉀處理，說(shuō)明低鉀脅迫仍可刺激根系的代謝活動(dòng)。其中正常供鉀植株在生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)可溶性蛋白含量達(dá)到最大值，低鉀植株在生長(zhǎng)素濃度為5 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值，且差異達(dá)到顯著水平。綜合而言，低鉀脅迫可刺激植株根系中可溶性蛋白含量的增加，且無(wú)論正常供鉀還是低鉀情況下，外源添加生長(zhǎng)素對(duì)植株根系可溶性蛋白含量均有一定的改善作用。

Ma等[29]在進(jìn)行低鉀脅迫下水稻轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)，在33個(gè)植物激素中有22個(gè)與生長(zhǎng)素相關(guān)的基因發(fā)生了顯著變化，以上這些研究都說(shuō)明在植物中生長(zhǎng)素和鉀素營(yíng)養(yǎng)有著關(guān)聯(lián)。鉀素水平影響植物體內(nèi)生長(zhǎng)素的分布，在不同鉀素水平下煙株體內(nèi)生長(zhǎng)素的分布也表現(xiàn)出一定的規(guī)律性。本試驗(yàn)中，無(wú)論是主根尖、側(cè)根尖還是葉片中，添加不同濃度外源生長(zhǎng)素后，低鉀植株內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度整體高于相應(yīng)正常供鉀條件，說(shuō)明低鉀脅迫可刺激植物激素生長(zhǎng)素的合成，促進(jìn)各部位對(duì)生長(zhǎng)素的累積。添加外源生長(zhǎng)素以后，低鉀植株主根尖及側(cè)根尖內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度在外源生長(zhǎng)素濃度為0～20 μmol/L范圍內(nèi)變化不大；葉片內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度在外源生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到最小值，同時(shí)與正常供鉀無(wú)添加生長(zhǎng)素達(dá)到相同水平，說(shuō)明低鉀條件下過(guò)高的內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度可能抑制了葉片及植株的生長(zhǎng)，添加一定濃度的外源生長(zhǎng)素以后，在一定程度上緩解了高濃度的抑制作用，促進(jìn)煙株生長(zhǎng)發(fā)育，這與上面研究一系列結(jié)果基本一致。正常供鉀水平下添加外源生長(zhǎng)素以后，除了葉片內(nèi)源生長(zhǎng)素有略微降低趨勢(shì)以外，其余部位內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度均增加。所以在正常供鉀和低鉀水平下，適當(dāng)添加外源生長(zhǎng)素可增加相應(yīng)部位內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度，促進(jìn)植株生長(zhǎng)發(fā)育。

3.2 外源生長(zhǎng)素對(duì)不同鉀水平下植株體內(nèi)鉀素吸收的影響

代曉燕等[24]和洪麗芳等[11]研究表明，打頂后在煙株頂端涂抹生長(zhǎng)素也能夠提高煙草葉內(nèi)的鉀素含量，其是在頂端調(diào)控條件下進(jìn)行，本試驗(yàn)采用根系調(diào)控的方法與其得出相同的結(jié)論。研究發(fā)現(xiàn)，低鉀條件下施加生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)，根系和葉片鉀素濃度均達(dá)到最大值，說(shuō)明低鉀條件下通過(guò)適當(dāng)添加外源生長(zhǎng)素可以提高煙株整株的鉀含量，而生長(zhǎng)素同樣也影響著煙株鉀素的累積分布。而在正常供鉀條件下，施加外源生長(zhǎng)素以后，根系和葉片中的鉀素濃度均表現(xiàn)為不同程度的降低，這可能與其內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度的變化有關(guān)，其機(jī)理還需進(jìn)一步研究探討。

用根系鉀吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)更能進(jìn)一步定量描述植株根系對(duì)養(yǎng)分的吸收情況。Vmax值越大，表示植株對(duì)鉀離子的吸收速率越大，對(duì)鉀離子的吸收能力越強(qiáng)，Km越小，表示對(duì)鉀離子的親和力越高。結(jié)果表明 (表4)，正常供鉀情況下，在生長(zhǎng)素濃度為5 μmol/L時(shí)，煙株的Vmax表現(xiàn)最大，高達(dá)生長(zhǎng)素濃度為0 μmol/L時(shí)的2.26倍；Km則表現(xiàn)為持續(xù)降低趨勢(shì)，這可能是由于苗齡的影響。低鉀情況下，當(dāng)生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)煙株Vmax值最大而Km值最小，表示對(duì)鉀離子的吸收和親和力最強(qiáng)。由上可知，無(wú)論正常供鉀還是低鉀條件下，施加適當(dāng)濃度的生長(zhǎng)素可以提高植株對(duì)鉀離子的吸收能力，進(jìn)而提高植株鉀含量。

同時(shí)，本研究進(jìn)一步分析了煙草相關(guān)的鉀離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因NKT2、NtKC1、Ntork1的表達(dá)情況。NKT2主要負(fù)責(zé)參與轉(zhuǎn)運(yùn)K+的作用，它能調(diào)控韌皮部細(xì)胞膜電壓，和NKT1基因一起分擔(dān)葉內(nèi)細(xì)胞K+的滲透。本試驗(yàn)中，無(wú)論根系還是葉片，低鉀水平下NKT2的相對(duì)表達(dá)量整體高于正常供鉀水平下。正常供鉀水平下，在外源生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)，根系和葉片中NKT2的相對(duì)表達(dá)量最高，說(shuō)明適當(dāng)添加了生長(zhǎng)素后對(duì)提高鉀素的運(yùn)輸來(lái)說(shuō)還是有利的，低鉀條件下也幾乎符合此規(guī)律。擬南芥中的AtKC1基因主要在根毛區(qū)和根的內(nèi)皮層中表達(dá)，是根毛鉀離子吸收通道的重要組成單位，本試驗(yàn)中，正常供鉀情況下在外源生長(zhǎng)素濃度為20 μmol/L時(shí)各部位NtKC1的相對(duì)表達(dá)量最高，而低鉀情況下在外源生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L最高，說(shuō)明在不同的鉀水平下，可添加不同的生長(zhǎng)素來(lái)提高根系鉀素運(yùn)輸。Ntork1基因主要在葉片保衛(wèi)細(xì)胞和根表皮木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中表達(dá)，屬于外流型鉀離子通道，本試驗(yàn)中無(wú)論正常供鉀還是低鉀，其表達(dá)量均在外源生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L的最低，因?yàn)槠鋵儆谕饬餍外涬x子通道，所以說(shuō)明在正常和低鉀條件下添加10 μmol/L的外源生長(zhǎng)素可有效抑制鉀離子的外流，從而提供煙株體內(nèi)鉀離子濃度。

植物對(duì)K+的吸收通過(guò)高親和系統(tǒng)[低外部K+濃度(1～200 μmol/L)，通過(guò)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主動(dòng)運(yùn)輸]和低親和系統(tǒng)[高外部K+濃度 (1～10 mmol/L)，通過(guò)鉀離子通道被動(dòng)運(yùn)輸]進(jìn)行。本試驗(yàn)主要研究低鉀脅迫即高親和系統(tǒng)，鉀離子通道是鉀離子吸收的其中一個(gè)途徑。孫小茗[30]研究表明，在外源K+濃度為5 mmol/L時(shí)，將通道抑制后，K+的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移過(guò)程有很大一部分是通過(guò)載體蛋白組成的高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來(lái)完成的。其研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同時(shí)添加通道抑制劑TEA和載體抑制劑NEM后，植物仍然可以吸收部分鉀，而且這種情況隨介質(zhì)中鉀離子濃度的增加而更趨明顯，這種途徑很可能就是非選擇性離子通道 (NSCCs)[31-32]。說(shuō)明植株對(duì)鉀離子的吸收不只是局限于已知的兩種機(jī)制，且目前對(duì)于煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究較少，尚不成熟，而對(duì)鉀離子通道的研究日趨完善，所以本試驗(yàn)對(duì)鉀離子通道的測(cè)定研究具有一定的參考價(jià)值和研究意義。

4 結(jié)論

1) 在未添加外源生長(zhǎng)素條件下，與正常供鉀處理相比，低鉀脅迫可明顯抑制植株根系生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)鉀素的吸收累積。

2) 當(dāng)施用外源生長(zhǎng)素以后，隨著生長(zhǎng)素濃度的升高，正常供鉀和低鉀植株的根系干重、根系活力、主根尖及側(cè)根尖內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度均有增加的趨勢(shì)，且鉀吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax值和NKT2和NtKC1的表達(dá)量明顯增加。其中低鉀植株根系生長(zhǎng)狀況明顯改善，地上地下部鉀素濃度提高，Ntork1的表達(dá)量降低。

3) 無(wú)論正常供鉀或是低鉀，當(dāng)添加外源生長(zhǎng)素濃度為10 μmol/L時(shí)，可明顯改善植株根系的生長(zhǎng)發(fā)育，提高內(nèi)流型通道基因NKT2和NtKC1的表達(dá)量，降低外流型通道基因Ntork1的表達(dá)量，提高煙株對(duì)鉀離子的吸收能力與親和力，從而增加植株鉀含量。