范陳良,李小四*，馮 燕，姚 婭，周 雪，宋國蓉，馮雪君，倪侃翔

0 引言

膽囊結(jié)石是臨床上最常見的膽道疾病，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率越來越高，發(fā)病年齡已逐漸年輕化[1]。膽囊結(jié)石多伴發(fā)急性或慢性膽囊炎，誘發(fā)膽道系統(tǒng)感染，膽囊結(jié)石和膽道系統(tǒng)感染互為因果、相互作用。為探討嘉興地區(qū)膽囊結(jié)石伴膽囊炎患者膽汁中的病原學(xué)資料，本研究回顧性分析我院2017年1-12月確診膽石癥合并膽囊炎癥患者膽汁中的病原菌分布和耐藥性特征，旨在為肝膽外科圍手術(shù)期或膽石癥伴感染患者保守治療提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 回顧2017年1-12月嘉興市第二醫(yī)院就診患者中確診膽囊結(jié)石伴膽囊炎并送檢膽汁培養(yǎng)患者1 505例，其中男551例，女954例，平均年齡(56.3±7.4)歲，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)腹部超聲檢測和CT檢查擬診膽囊結(jié)石；②合并有膽囊炎癥表現(xiàn)：突發(fā)性右上腹和(或)劍突下陣發(fā)性疼痛和(或)伴有惡心、嘔吐等癥狀，發(fā)熱、黃疸和(或)Murphy征陽性等。

1.1.2 菌株來源 回顧2017年1-12月以上臨床資料所對應(yīng)的膽汁培養(yǎng)陽性菌株，剔除同一患者同一部位重復(fù)分離菌株；質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923/ATCC29213、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853均購自衛(wèi)生部臨檢中心。

1.1.3 儀器及試劑 BD-Phoenix全自動微生物鑒定系統(tǒng)及配套鑒定和藥敏卡(BD公司)；VITEK-2 Compact型全自動微生物鑒定系統(tǒng)及配套鑒定卡和藥敏卡(梅里埃公司)；藥敏紙片全部來自英國Oxoid公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與鑒定 分離純化后的菌落，經(jīng)全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定細(xì)菌的具體種類。

1.2.2 藥物敏感性試驗 用BD-Phoenix型全自動微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī)藥物敏感性試驗，并對操作做全程質(zhì)量控制，質(zhì)控菌株為ATCC29213、ATCC25922和ATCC27853；藥敏結(jié)果判讀參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M100-S26(CLSI M100-S26)[2]；真菌藥物敏感性試驗采取梅里埃真菌板條執(zhí)行。

1.2.3 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)檢測 經(jīng)全自動微生物鑒定系統(tǒng)初篩大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中產(chǎn)ESBLs菌株，并按CLSI推薦的表型確證試驗復(fù)核。

1.2.4 耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌驗證 經(jīng)全自動微生物鑒定系統(tǒng)及藥敏紙片擴散法初篩為耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌，并按照CLSI推薦的改良Hodge試驗確認(rèn)復(fù)核。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用WHONET 5.5軟件分析耐藥率；采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析耐藥率差異，率的比較使用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原菌臨床分布 2017年1-12月共有526株膽汁培養(yǎng)陽性菌株，幾乎全部來自肝膽外科病區(qū)(98.1%，516/526)，康復(fù)病區(qū)和ICU病區(qū)散在分布(1.9%，10/526)。

2.2 病原菌分布 共獲得革蘭陰性桿菌360株(68.4%)、革蘭陽性菌147株(27.9%)、真菌19株(3.6%)；最常見的病原菌依次是大腸埃希菌(26.4%)、肺炎克雷伯菌(12.0%)、屎腸球菌(7.8%)、糞腸球菌(7.2%)和陰溝腸桿菌(6.3%)；革蘭陰性桿菌中最常見的病原菌是大腸埃希菌(26.4%，139/526)、肺炎克雷伯菌(12.0%，63/526)和陰溝腸桿菌(6.3%，33/526)；革蘭陽性菌中主要是屎腸球菌(7.8%，41/526)、糞腸球菌(7.2%，38/526)和鏈球菌屬(19/526，3.6%)；真菌中最常見的是白假絲酵母菌(3.0%，16/526)。見表1。

2.3 主要革蘭陰性菌對常見抗菌藥物的耐藥性

大腸埃希菌中，51.1%菌株產(chǎn)ESBLs，對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率高，但對亞胺培南、美羅培南、阿米卡星和替加環(huán)素的敏感性較好；肺炎克雷伯菌中，有30.0%菌株產(chǎn)ESBLs，對常見抗菌藥物具有較好敏感性；耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌為3.0%，對第3代頭孢菌素類藥物(頭孢噻肟、頭孢他啶)耐藥率較高。見表2。

表1 膽囊結(jié)石伴膽囊炎癥患者膽汁中病原菌分布及構(gòu)成比

注：*包括金黃色葡萄球菌、C2群沙門菌、宋內(nèi)志賀菌、溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、柯氏枸櫞酸桿菌、黏質(zhì)沙雷菌、摩根菌、惡臭假單胞菌、產(chǎn)酸克雷伯菌等

表2 主要革蘭陰性菌對常見抗菌藥物的不敏感率

注：—表示天然耐藥；不敏感率包括中介率和耐藥率

2.4 主要革蘭陽性菌對常見抗菌藥物的耐藥性 屎腸球菌中未檢出萬古霉素耐藥菌株，對萬古霉素、利奈唑胺敏感性最高；耐萬古霉素糞腸球菌檢出率為2.6%，利奈唑胺和氨芐西林具有較高敏感性。見表3。

表3 主要革蘭陽性菌對常見抗菌藥物的不敏感率(%)

注：—表示未檢測；不敏感率包括中介率和耐藥率

3 討論

膽道感染常是繼發(fā)性感染，機體在生理條件下，膽道系統(tǒng)并沒有微生物生長，只有膽道系統(tǒng)發(fā)生梗阻、狹窄、膽汁淤積等病理性改變時，膽汁無法排入腸腔，膽道壓力上升，腸道內(nèi)的菌群逆行進(jìn)入膽道系統(tǒng)，繼而引起膽道系統(tǒng)感染[3]。膽道感染也是臨床上膽道手術(shù)常見的并發(fā)癥之一，由于手術(shù)位置及部分生理的特殊性，膽汁培養(yǎng)極易產(chǎn)生多重耐藥菌，膽道手術(shù)術(shù)后感染成為一個較為棘手的問題。因此，加強膽道感染病原學(xué)檢查以及抗菌藥物的敏感性試驗，避免濫用抗菌藥物；回顧性分析膽汁培養(yǎng)病原菌及耐藥性的流行病學(xué)資料，對術(shù)后合理選擇抗菌藥物尤為重要[4]。

本研究結(jié)果顯示，膽汁培養(yǎng)的病原菌主要以革蘭陰性菌為主，其次是革蘭陽性菌和念珠菌，這與李平等[3,5-6]的報道一致，但本研究中最常見的4種病原菌依然是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌和糞腸球菌，與以往文獻(xiàn)報道略有差異，筆者認(rèn)為這可能與手術(shù)部位、患者機體內(nèi)腸道菌群差異以及本地區(qū)膽道系統(tǒng)感染特定流行病原譜有關(guān)，膽道手術(shù)患者術(shù)前糞便菌群分析和術(shù)后膽汁培養(yǎng)數(shù)據(jù)的對比研究目前正在進(jìn)行中。

膽囊結(jié)石伴膽囊炎患者大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的ESBLs酶攜帶率均較高，總ESBLs攜帶率達(dá)到44.6%，高于王軍等[5-6]的報道。ESBLs是一類由質(zhì)粒編碼介導(dǎo)的可以水解滅活青霉素類抗菌藥物、頭孢菌素(主要為第3代頭孢菌素，如頭孢他啶、頭孢噻肟等)和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物(氨曲南等)的水解酶類統(tǒng)稱，但對碳青霉烯類抗菌藥物無水解能力。大陸地區(qū)主要以CTX-M型為主[7]，CTX-M型EBSLs對頭孢噻肟的水解能力強于對頭孢他啶，這與本研究大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對頭孢噻肟的不敏感率高于頭孢他啶相符，表明嘉興地區(qū)膽道系統(tǒng)感染患者膽汁培養(yǎng)的病原菌攜帶的ESBLs酶，可能主要是CTX-M型，具體CTX-M亞型有待于進(jìn)一步研究。結(jié)果顯示，對于大腸埃希菌引起的膽道感染，碳青霉烯類抗菌藥物(亞胺培南、美羅培南)、阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦是目前治療膽道感染中大腸埃希菌的理想經(jīng)驗藥物，頭孢類抗菌藥物并非最佳選擇，且產(chǎn)ESBLs酶的大腸埃希菌對臨床常用抗菌藥物的不敏感性明顯高于非產(chǎn)ESBLs酶的菌株，但對碳青霉烯類抗菌藥物的不敏感性并無明顯差異，這可能與本研究中碳青霉烯類抗菌藥物在膽汁分離的大腸埃希菌中的耐藥率極低有關(guān)；肺炎克雷伯菌對常見抗菌藥物的敏感性均較好，左氧氟沙星、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、復(fù)方新諾明依舊是治療的最佳選擇，產(chǎn)ESBLs酶的肺炎克雷伯菌對臨床常用抗菌藥物的不敏感性明顯高于非產(chǎn)ESBLs酶的菌株，美羅培南和復(fù)方新諾明在兩者之間并沒有明顯差異。但產(chǎn)ESBLs酶的肺炎克雷伯菌對亞胺培南的不敏感性明顯高于非產(chǎn)ESBLs酶的菌株，提示嘉興地區(qū)膽汁感染的肺炎克雷伯菌，亞胺培南的耐藥機制與ESBLs酶的類型間可能存在一定相關(guān)性，有待于進(jìn)一步分子水平研究，臨床分離的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的主要機制是產(chǎn)KPC-2酶合并細(xì)菌外膜蛋白異常[8]，碳青霉烯類抗菌藥物是腸桿菌科細(xì)菌治療的最后防線，面對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌或大腸埃希菌時，可選擇的治療藥物并不多，如替加環(huán)素、多粘菌素、或者聯(lián)合用藥，但不良反應(yīng)大，在治療的過程中易發(fā)生對替加環(huán)素的繼發(fā)性耐藥[9]。結(jié)果表明，對于膽汁中分離的陰溝腸桿菌，阿米卡星、美羅培南、亞胺培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星是理想的經(jīng)驗選擇用藥，陰溝腸桿菌的檢出率與李平等[6]的報道基本一致，但與王軍等[5]的報道存在一定差異，本研究中陰溝腸桿菌的檢出率高于銅綠假單胞菌等非發(fā)酵菌，筆者認(rèn)為這可能與嘉興地區(qū)膽石癥合并膽道感染患者腸腔菌群以及院感相關(guān)，有待進(jìn)一步證實。

本研究結(jié)果顯示，萬古霉素、利奈唑胺、氨芐西林和環(huán)丙沙星是膽道系統(tǒng)感染糞腸球菌的最佳選擇。值得注意的是，氨芐西林和環(huán)丙沙星在糞腸球菌中的敏感性明顯高于屎腸球菌，氨芐西林和氟喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星)已不再是膽汁中屎腸球菌感染的最佳選擇。提示臨床科室應(yīng)該重視實驗室菌株鑒定結(jié)果和藥敏結(jié)果，合理選擇抗菌藥物。本文中嘉興地區(qū)膽囊結(jié)石伴膽囊炎患者膽汁中屎腸球菌的檢出率稍高于糞腸球菌，與紹興、濟南等[10-12]地區(qū)膽汁中腸球菌屬的檢出情況存在一定差異，筆者認(rèn)為這可能與以下兩方面因素有關(guān)：①不同地區(qū)、不同醫(yī)院的臨床與實驗室中的院感情況差異；②本文中的腸球菌的菌株數(shù)量偏少。另外，屎腸球菌對氨芐西林的耐藥率明顯低于茅國峰等[10]的報道，筆者認(rèn)為這可能與嘉興地區(qū)膽汁中的屎腸球菌克隆型與其他地區(qū)存在一定差異有關(guān)[13]，實驗室將展開腸球菌克隆分型及耐藥性的相關(guān)研究；也可能與本文納入的屎腸球菌數(shù)量偏少(41株)有一定關(guān)系。腸球菌中，僅1株糞腸球菌對萬古霉素的敏感性下降(原始數(shù)據(jù)未給出)，與孫斌等[11]的報道基本一致，提示萬古霉素對糞腸球菌和屎腸球菌依舊表現(xiàn)出強大的抗菌活性，但應(yīng)警惕萬古霉素耐藥的腸球菌院內(nèi)流行。預(yù)防萬古霉素耐藥的腸球菌暴發(fā)主要包括以下3個方面[14-16]：①抗菌藥物的分級、合理使用，嚴(yán)格用藥指針，正確解讀微生物科的檢測結(jié)果；②接觸隔離，降低交叉感染，預(yù)防潛在暴發(fā)；③定期監(jiān)測,包括日常監(jiān)測和主動監(jiān)測，尤其是ICU患者、移植患者、腎透析患者等高危易感人群的監(jiān)測。研究顯示，耐萬古霉素腸球菌的耐藥機制主要與藥物結(jié)合的靶位改變有關(guān)，介導(dǎo)靶位改變的基因型分為VanA、VanB、VanC、VanD、VanE、VanG、VanL、VanM和VanN共9種，其中VanA、VanB、VanD、VanG、VanL、VanM和VanN為獲得性耐藥基因，VanC和VanE為先天性耐藥基因[17]。

對膽道系統(tǒng)感染的治療主要涉及3個方面：解除梗阻因素、通暢引流和抗菌藥物合理使用。但是臨床用藥時機和獲取準(zhǔn)確的病原微生物的藥敏報告之間存在一定的時間差，基于膽汁中病原菌的流行病學(xué)資料，經(jīng)驗性用藥依舊重要，在經(jīng)驗性選擇抗菌藥物的同時，應(yīng)該充分考慮以下幾點：①藥物在膽汁中的濃度；②藥物的敏感性；③聯(lián)合用藥；④流行病學(xué)資料；⑤藥物的代謝途徑以及藥物的次級代謝產(chǎn)物的抗菌活性。研究表明，哌拉西林/他唑巴坦在膽汁中的濃度可達(dá)到血藥濃度的10倍以上[18]。本研究結(jié)果顯示，哌拉西林/他唑巴坦也是感染性膽囊炎的理想經(jīng)驗用藥。本院雖并未對膽汁中的厭氧菌做相關(guān)研究，但有報道顯示，膽汁中的厭氧菌感染及其與需氧菌導(dǎo)致的混合感染占膽道感染總病例的50%～90%，尤其在急性化膿性重癥膽管炎中最為常見[19-20]，甲硝唑是臨床上較為經(jīng)典的抗厭氧菌藥物，目前對一般常見厭氧菌具有較高的敏感性，且在膽汁中具有較高的富集濃度和較長的有效藥物作用時間[19]，在微生物報告沒有出來之前，可以聯(lián)合甲硝唑用于膽道系統(tǒng)感染的經(jīng)驗性用藥選擇，等待微生物科的準(zhǔn)確報告后再做相應(yīng)抗菌藥物的變更。

綜上所述，膽結(jié)石伴膽囊炎患者膽汁培養(yǎng)陽性率為34.9%；病原菌分布廣泛，以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為主，其次是屎腸球菌和糞腸球菌；而銅綠假單胞菌等腸道非發(fā)酵菌分離率較低；碳青霉烯類藥物和萬古霉素仍然具有較高的敏感性，肝膽外科圍手術(shù)期，臨床應(yīng)根據(jù)術(shù)中膽汁培養(yǎng)的流行病原菌及藥敏資料，合理使用抗菌藥物。