趙 莉 趙 帥 柯 浩 鮑恩東

（1.瑞普（天津）動物藥業(yè)有限公司，天津 300300；2.南京農業(yè)大學，江蘇南京 210095；3.丹陽市農業(yè)委員會，江蘇丹陽 212300）

干擾素（Interferon，IFN）是在特定的抗原刺激下由細胞分泌的一類具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)功能等生物活性的糖蛋白，是發(fā)現最早，研究最多的細胞因子。根據IFN的細胞來源和結合受體不同，將IFN分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型IFN主要有α、β兩個亞型，分別主要由淋巴細胞和成纖維細胞產生，它們作用于同一受體，可抑制病毒DNA復制和蛋白質合成，活化NK細胞，促進MHCⅠ類分子提呈抗原。Ⅱ型IFN為γ-干擾素，主要由T細胞和NK細胞產生[1]。豬α干擾素全基因為570bp，編碼189個氨基酸，其中前23個Aa為信號肽，后166個Aa為成熟活性蛋白。國內外研究表明，PoIFN-α在抑制豬流行性腹瀉病毒，藍耳病病毒和非洲豬瘟病毒的試驗中均取得了良好效果[2]。

目前，豬干擾素的來源有2種：提取豬血液中的白細胞誘導產生的白細胞干擾素和通過基因工程的方法發(fā)酵表達。從豬血液提取的白細胞干擾素是一種多種成份混合物，其抗病毒效價較低、生產成本高，而且存在潛在病原污染的問題；目前人類臨床上應用的干擾素全部是通過基因工程的方法生產的，其產品活性高、質量標準容易控制。隨著生物工程技術的迅猛發(fā)展，應用基因工程方法進行微生物發(fā)酵生產豬干擾素的生產成本大大降低，可以應用到養(yǎng)豬業(yè)，具有良好的應用前景。為此，本研究旨在探索重組畢赤酵母表達的重組豬α干擾素的體內外抗病毒活性，從而為豬病防治提供有效手段，減少病毒疾病的爆發(fā)給養(yǎng)豬業(yè)帶來的巨大損失。

1 材料和方法

1.1 材料

重組豬α干擾素（rPoIFN-α）凍干制品，由瑞普（天津）動物藥業(yè)有限公司制備；MDBK細胞由中國農科院哈爾濱獸醫(yī)研究所人畜共患病實驗室保存；DMEM培養(yǎng)基購于Invitrogen公司；表達綠色熒光蛋白報告基因的重組水皰性口炎病毒VSV *GFP由中國農科院哈爾濱獸醫(yī)研究所人畜共患病實驗室構建、滴定并保存。

1.2 重組豬α干擾素抗病毒活性測定

1.2.1 待檢測樣品的準備

在重組豬α干擾素凍干制品中加入1ml DMEM，徹底溶解后，吸取100μl至900μl DMEM中，再依次進行10倍梯度稀釋直至10-8，待用。

1.2.2 細胞制備

將細胞培養(yǎng)瓶中生長狀態(tài)良好的MDBK細胞用0.25%胰酶消化后，用含5%胎牛血清的DMEM（不含雙抗）將細胞密度調整為2×105個細胞/ml，待用。

1.2.3 抗病毒活性測定

采用VSV*GFP-MDBK細胞系統，細胞病變抑制法測定重組豬α干擾素抗病毒活性。先在96孔板中加入10倍梯度稀釋的重組豬α干擾素樣品，每孔100μl，再將稀釋好的MDBK細胞鋪于 96孔板，每孔100μl，37℃溫箱放置24 h后，每孔加入100μl（3×104PFU）VSV*GFP感染MDBK細胞，1h后換DMEM完全培養(yǎng)液，37℃溫箱放置17 h后，置熒光顯微鏡下觀察結果，并以Microplate Fluorescence Reader FLx 800（BIO-TEKINSTRUMENTS.INC）讀取熒光數量。以能抑制50%細胞病變（即不加重組豬α干擾素的對照孔熒光數量的一半）的重組豬α干擾素最高稀釋度定義為1個單位（IU）。另設不加重組豬α干擾素孔為空白對照[3]。

2 結果

2.1 熒光顯微鏡觀察結果

利用VSV*GFP-MDBK細胞病變抑制法測定重組豬α干擾素抗病毒活性。以不同濃度重組豬α干擾素作用MDBK細胞24h后，感染VSV*GFP，17h后熒光顯微鏡觀察結果。1×104倍稀釋的重組豬α干擾素可以完全抑制VSV*GFP在MDBK細胞上的復制，熒光信號呈陰性（圖1-A），1×105和1×106倍稀釋的重組豬α干擾素可部分抑制VSV*GFP的復制（圖1-B，1-C），未加重組豬α干擾素空白對照孔出現大量熒光（圖1-D）。定義熒光亮度為空白對照孔50%的最高稀釋度為一個單位，故重組豬α干擾素活性為1×105IU/0.1ml。

2.2 以Microplate Fluorescence Reader FLx 800讀取熒光蛋白GFP熒光數量

空白對照孔的熒光數量均值為1600，則CPE50為800；重組豬α干擾素樣品檢測孔熒光數量均值：105倍稀釋孔為620，106倍稀釋孔為1522；則按照Reed-Muench法計算如下：

距離比例=（800-620）/（1522-620）=0.2lgCPE50=-5+0.2×（-1）=-5.2，則重組豬α干擾素樣品CPE50=10-5.2IU/0.1ml。即將該干擾素樣品作105.2稀釋后，0.1ml即能抑制50%病毒對細胞的感染作用。定義熒光亮度為空白對照孔50%的最高稀釋度為一個單位，則重組豬α干擾素樣品的活性單位為1×105.2IU/0.1ml。

圖1 利用VSV*GFP－MDBK系統測定rPoIFN-α抗病毒活性

3 討論

α-干擾素具有較強的抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)等生物學活性，人α-干擾素在臨床疾病的防治中早有應用，動物α-干擾素作為抗病毒生物制劑或疫苗佐劑也具有較好的應用前景，許多國家已經將動物細胞因子的開發(fā)利用作為研究重點。α-干擾素基因在正常情況下處于抑制狀態(tài)，只有在某些刺激因子的刺激下才能表達，產量低、純化困難、成本比較高，難以大量制備，隨著基因工程技術的迅速發(fā)展，可以利用該技術大量制備α-干擾素。

傳統的干擾素抗病毒活性是利用細胞病變抑制法測定，通過噬斑的數量而確定其活性單位，本研究采用的重組VSV*GFP可以在宿主細胞內復制，并表達綠色熒光蛋白，通過觀察熒光強度和數量，即可確定其感染和復制情況。因此使用VSV*GFP作為攻擊病毒，在MDBK細胞上測定重組豬α干擾素抗病毒活性時，采用測定熒光強度或數量代替?zhèn)鹘y的噬斑數量計數而確定其活性單位，使得干擾素抗病毒活性的測定更加準確和簡便。