張譽(yù)泓 戚孟春 董偉 孫紅

1.華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科教研室 唐山 063000；

2.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室 唐山 063000

許多骨過(guò)度吸收性疾?。ㄈ绻琴|(zhì)疏松、Paget氏病、多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性/轉(zhuǎn)移性骨腫瘤、牙周炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等）在臨床上均表現(xiàn)為破骨細(xì)胞（osteoclasts）數(shù)目和活性的異常升高[1-2]。對(duì)上述疾病的治療，最主要的方法是抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，因此有關(guān)破骨細(xì)胞分化調(diào)控的研究顯得尤為重要。

Ca2+/鈣調(diào)蛋白（calmodulin）/活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T-cell，NFATc）1 是破骨細(xì)胞生成的重要信號(hào)通路之一。在鈣調(diào)蛋白下游，鈣調(diào)蛋白依賴性激酶（calmodulin-dependent kinase，CaMK）是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin）之外的另一類信號(hào)分子，CaMK包括CaMKⅠ、CaMKⅡ、CaMKⅣ。在CaMKⅡ的4個(gè)異構(gòu)體（α、β、γ、δ）中，CaMKⅡδ在破骨細(xì)胞分化不同階段均呈持續(xù)性高表達(dá)，提示其作用可能更加關(guān)鍵[3]。破骨細(xì)胞經(jīng)核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）誘導(dǎo)后，調(diào)控下游c-Fos、c-Jun、環(huán)腺苷酸反應(yīng)原件結(jié)合蛋白（cyclic adenosine mono phosphate responsive elementbinding protein，CREB）等一系列信號(hào)分子[4-6]。然而，CaMKⅡδ對(duì)破骨細(xì)胞中c-fos、c-jun、CREB的表達(dá)發(fā)揮怎樣的調(diào)控作用，目前還知之甚少。本研究通過(guò)構(gòu)建CaMKⅡδ慢病毒干擾載體，探索其在mRNA和蛋白質(zhì)水平對(duì)c-fos、c-jun、CREB表達(dá)的影響，以揭示CaMKⅡδ調(diào)控破骨細(xì)胞可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

小鼠白血病單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）；RANKL及胎牛血清（Biovision公司，美國(guó)）；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM；Hyclone公司，美國(guó)）；耐酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（Sigma公司，美國(guó)）；兔抗鼠CaMKⅡδ單克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)）；小鼠單克隆c-Fos抗體、兔單克隆c-Jun抗體（Abcam公司，英國(guó)）；兔抗鼠CREB抗體（Cell Signaling Techonlogy公司，英國(guó)）；SYBR PremixEx TaqTM（TaKaRa公司，日本）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物（Invitrogen公司，美國(guó)）等。

1.2 CaMKⅡδ RNA干擾效率測(cè)定

筆者課題組[7]在前期研究中成功構(gòu)建了重組慢病毒CaMKⅡδ小干擾RNA（small interfe ring RNA，siRNA）載體。以最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）等于30轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，將RAW264.7細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、陰性載體組和干擾載體組。病毒轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基；1 d后加入50 ng·mL-1RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。于RANKL誘導(dǎo)5 d后收獲細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），使用Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。CaMKⅡδ引物：上游5’-CAGTGGAGCTGTCTGTCGTT-3’，下游5’-GCAGACTACCACGCA ACTCA-3’（409 bp）；編碼內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白的基因（NM_007393.3）的引物，上游5’-GTTGGAGCAAACATCCCCCA-3’，下游5’-CGCGACCATCCTCCTCTTAG-3’（186 bp）。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 15 s、55 ℃ 20 s、72 ℃20 s，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)Rotor-Gene軟件自動(dòng)計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)水平。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)副孔，并重復(fù)3次。

Western-blotting檢測(cè)：放射免疫沉淀分析法提取3組細(xì)胞總蛋白質(zhì)，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。加入5倍濃度上樣緩沖液，煮沸變性，電泳并轉(zhuǎn)膜；5%牛血清白蛋白室溫封閉后加兔抗鼠CaMKⅡδ一抗4 ℃孵育過(guò)夜。羊抗兔二抗孵育40～60 min，ECL顯色儀上顯色1 min，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參。Image J軟件檢測(cè)膜上蛋白質(zhì)條帶的灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 CaMKⅡδ基因沉默對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響

TRAP染色：5 d后收獲的細(xì)胞用多聚甲醛固定。純水洗滌細(xì)胞3次，固定0.5～1 h，純水洗滌細(xì)胞爬片。配制染色液、反應(yīng)液。取固定后的細(xì)胞，每孔加入0.5 mL反應(yīng)液，37 ℃避光靜止放置，染色1 h；吸去反應(yīng)液，純水沖洗，滴加蘇木精進(jìn)行細(xì)胞核染色15～30 s；滴加甘油封片，用200倍光學(xué)顯微鏡觀察，記錄每個(gè)視野中細(xì)胞核數(shù)目大于或等于3個(gè)且細(xì)胞質(zhì)呈紅色的破骨細(xì)胞數(shù)目，共觀察6個(gè)視野，取平均值。

牛骨吸收陷窩檢測(cè)：制備新鮮牛骨骨密質(zhì)磨片（厚約0.2 mm），滅菌后將三代以內(nèi)細(xì)胞以2×104cm-2接種其上。3組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)處理5 d后收獲骨磨片，掃描電子顯微鏡觀察。放大500倍條件下隨機(jī)選取6個(gè)視野觀察吸收陷窩，應(yīng)用圖像分析軟件Med 6.0測(cè)量吸收陷窩的數(shù)目和面積總和，每組檢測(cè)5個(gè)磨片。

1.4 CaMKⅡδ基因沉默對(duì)c-fos、c-jun、CREB表達(dá)的影響（NM_007393.3）

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；用Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。β-肌動(dòng)蛋白基因的引物：上游5’-GT TGGAGCAA ACATCCCCCA-3’，下游5’-CGCG AC CATCCTCCTCTTAG-3’（186 bp）；c-fos引物：上游5’- GGCTTTCCCCAAACTTCGAC-3’，下游5’- GCGCAAAAGTCCTGTGTGTT-3’（173 bp）；c-jun引物：上游5’-TGGGAGGGGTTACAA ACTGC-3’，下游5’-TAGCCTGGCACTTAC- AAGCC-3’（109 bp）；CREB引物：上游5’-CCGAATTCATGACCATGGA ATCTGGAGC-3’，下游5’-GGTCTAGATTAATCT GATTTGTGGCAGT-3’（109 bp）。c-fos、c-jun和CREB基因的登記號(hào)分別是NM_010234.2、NM_010591.2和NM_001037726.1。

PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，然后95 ℃15 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)Rotor-Gene軟件自動(dòng)計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)水平。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)副孔，并重復(fù)3次。

1.5 CaMKⅡδ基因沉默對(duì)c-Fos、c-Jun、CREB的影響

病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞1 d后，加入50 ng·mL-1RANKL誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化，并于誘導(dǎo)作用2 d后收獲細(xì)胞，Western-blotting檢測(cè)c-Fos、c-Jun、CREB，方法同前。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)1.2中數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)1.3～1.5數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CaMKⅡδ siRNA慢病毒載體干擾效率測(cè)定

經(jīng)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，對(duì)照組、陰性載體組和干擾載體組中CaMKⅡδ mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.282±0.234、0.950±0.275和0.377±0.148（P＜0.05）；對(duì)照組與陰性載體組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而干擾載體組較對(duì)照組下降了70.6%（P＜0.01），也就是mRNA干擾效率為70.6經(jīng)Western-blotting檢測(cè)（圖2），對(duì)照組、陰性載體組和干擾載體組中CaMKⅡδ的相對(duì)表達(dá)水平（與β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)水平的比值）分別為1.063 ±0.457、1.006±0.139和0.295±0.032；對(duì)照組與陰性載體組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干擾載體組中CaMKⅡδ的水平較對(duì)照組下降了72.2 %（P＜ 0.01），即在蛋白質(zhì)水平，干擾效率為72.2 %。

圖 1 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)CaMKⅡδ mRNA水平Fig 1 CaMKⅡδ mRNA levels detected by real-time PCR

圖 2 Western-blotting檢測(cè)CaMKⅡδ表達(dá)水平Fig 2 CaMKⅡδ levels detected by Western-blotting

2.2 CaMKⅡδ基因沉默對(duì)破骨細(xì)胞生成、分化功能的影響

細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，3組細(xì)胞均出現(xiàn)了TRAP染色陽(yáng)性的多核破骨細(xì)胞，空白對(duì)照組和陰性載體組細(xì)胞質(zhì)紅染的多核破骨細(xì)胞的數(shù)目較多，體積較大；干擾載體組細(xì)胞質(zhì)紅染的多核破骨細(xì)胞的數(shù)目較少，體積小。定量數(shù)據(jù)表明，干擾載體組中紅染破骨細(xì)胞數(shù)目為4.0±1.6，較對(duì)照組（12.7±2.5）及陰性載體組（11.0±1.6）明顯減少，分別下降68.5%和63.6%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組和陰性載體組間細(xì)胞質(zhì)紅染的多核破骨細(xì)胞的數(shù)目無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，CaMKⅡδ基因沉默可顯著抑制破骨細(xì)胞分化。

掃描電鏡觀察，3組細(xì)胞在牛骨磨片上均有不同程度的骨吸收陷窩形成，其中干擾載體組吸收陷窩數(shù)目明顯低于對(duì)照組和陰性載體組（圖3）。定量分析表明，干擾載體組中骨吸收陷窩的數(shù)目為3.0±2.3，骨吸收陷窩的面積為（2 437.0±143.7）μm2，顯著低于對(duì)照組中的10.0±2.7和（5 694.0±536.2）μm2以及陰性載體組中的12.0±1.2和（5 247.0±635.2）μm2，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，干擾載體組骨吸收陷窩的數(shù)目較對(duì)照組和陰性載體組分別下降了67.1%和65.7%，干擾載體組中骨吸收陷窩的面積較對(duì)照組和陰性載體組分別下降了52.3%和48.2%。對(duì)照組與陰性載體組相比，破骨細(xì)胞數(shù)目、骨吸收陷窩的數(shù)目和面積的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CaMKⅡδ基因沉默可顯著抑制破骨細(xì)胞生成和分化。

圖 3 TRAP、牛骨吸收陷窩檢測(cè)破骨細(xì)胞的形成Fig 3 Osteoclast differentiation detected by TRAP and bovine bone resorption lacuna

2.3 CaMKⅡδ基因沉默對(duì)c-fos、c-jun、CREB表達(dá)的影響

經(jīng)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)（圖4），對(duì)照組、陰性載體組和干擾載體組中c-fos mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.97、0.98±0.86和0.26±0.19（P＜0.05）；c-jun mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.0±0.89、1.04±0.93和0.76±0.63（P＜0.05）；CREB mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.92、0.94±0.79和0.51±0.48（P＜0.05）。對(duì)照組與陰性載體組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而干擾載體組c-fos mRNA、c-jun mRNA和CREB mRNA相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組分別下降了7 4%、2 4%和4 9%（P＜0.01）。

圖 4 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)c-fos mRNA、c-jun mRNA和CREB mRNA水平Fig 4 c-fos mRNA, c-jun mRNA and CREB mRNA detected by real-time PCR

2.4 CaMKⅡδ基因沉默對(duì)c-Fos、c-Jun和CREB表達(dá)的影響

經(jīng)過(guò)Western-blot檢測(cè)，各組蛋白質(zhì)條帶的情況如圖5所示，干擾載體組c-Fos、c-Jun、CREB與β-肌動(dòng)蛋白的比值分別為0.33±0.02、0.41±0.03和0.49±0.05，顯著低于對(duì)照組的1.27±0.14、1.05±0.96和1.12±0.13（P＜0.05），分別下降了74.3%、61.3%和59.2%。蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，CaMKⅡδ基因沉默可顯著抑制c-F 和CREB的表達(dá)。

圖 5 Western-blotting檢測(cè)c-Fos、c-Jun和CREB表達(dá)Fig 5 Expression of c-Fos, c-Jun and CREB detected by Western-blotting

3 討論

破骨細(xì)胞在骨吸收過(guò)程中具有重要作用[8]。破骨細(xì)胞發(fā)揮作用是多種細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果，其中Ca2+/鈣調(diào)蛋白/NFATc1與核因子-κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/RANKL/骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）軸是破骨細(xì)胞生成、調(diào)控的重要信號(hào)通路，而核因子（nuclear factor，NF）-κB是RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化與成熟的重要轉(zhuǎn)錄因子。在RANKL激活NF-κB的同時(shí)，還調(diào)節(jié)多個(gè)破骨細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1、NFATc1。

破骨細(xì)胞中c-Fos的主要功能是通過(guò)促進(jìn)NFATc1的表達(dá)以及與NFATc1協(xié)同作用，觸發(fā)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化和功能活化中的多種靶基因的激活。c-Fos影響破骨細(xì)胞的增殖和分化，可能與其前體細(xì)胞向成熟轉(zhuǎn)化有關(guān)[9]。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除小鼠c-fos基因后，最先表現(xiàn)出骨硬化，而這種硬化是由破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的缺陷所致，說(shuō)明c-fos基因在破骨細(xì)胞的發(fā)育中起著重要的作用。在破骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，c-Jun也起著一定的作用。有報(bào)道[11]顯示，活化的c-Jun從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，誘導(dǎo)AP-1活化并激活特定的基因（如編碼基質(zhì)金屬蛋白酶和堿性磷酸酶的基因），刺激了破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的成熟，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化、存活、融合和活化。

c-Jun/c-Fos與NFATc1家族的相互聯(lián)系被認(rèn)為是RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究的結(jié)果顯示，CaMKⅡδ沉默抑制了c-fos、c-jun的表達(dá)及破骨細(xì)胞的分化。與王想福等[12]通過(guò)靶向抑制破骨細(xì)胞p38促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路中c-fos的表達(dá)抑制了破骨細(xì)胞吸收功能的結(jié)果相似。Izawa等[13]研究結(jié)果表明，c-Jun在破骨細(xì)胞的分化中起著重要的作用。因此，在調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和功能中，c-Fos、c-Jun有重要的作用。

CREB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在破骨細(xì)胞信號(hào)通路起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡδ沉默抑制了CREB。作為CaMK下游重要的信號(hào)分子，CREB的激活可以促進(jìn)原癌基因c-fos的表達(dá)，并且CREB家族中的某些成員可以與c-Jun形成二聚體。CREB被活化后，可進(jìn)入細(xì)胞核并與NFATc1基因的啟動(dòng)子相結(jié)合，參與NFATc1表達(dá)，調(diào)控破骨細(xì)胞分化[14-15]。

在本研究中，為了研究沉默CaMKⅡδ基因?qū)AW264.7細(xì)胞中c-fos、c-jun、CREB表達(dá)的影響以及CaMKⅡδ基因在破骨發(fā)生中的作用，采用RNA干擾技術(shù)成功構(gòu)建了針對(duì)CaMKⅡδ的siRNA重組慢病毒載體，特異性沉默CaMKⅡδ。結(jié)果證明，轉(zhuǎn)染siRNA載體病毒后，CaMKⅡδ在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)顯著降低。總之，本研究的結(jié)果表明，通過(guò)沉默CaMKⅡδ，可以抑制破骨細(xì)胞分化，下調(diào)了c-fos、c-jun和CREB基因的表達(dá)，說(shuō)明c-Fos、c-Jun、CREB參與了破骨細(xì)胞的分化。這將為研究破骨細(xì)胞所引起的疾病提供參考。 雖然相關(guān)機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究，CaMKⅡδ可能是一個(gè)有吸引力的治療骨吸收相關(guān)疾病的目標(biāo)分子。