田成成，宋文妍

非梗阻性無(wú)精癥（non-obstructive azoospermia，NOA）是目前男性生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。NOA約占成年男性的1%，占不育男性的10%～15%[1]，非染色體性的NOA病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，尤其是決定NOA患者生精數(shù)量的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。精子生成過(guò)程中基因缺失、突變或表達(dá)異常都可能引起精子生成障礙，導(dǎo)致男性不育癥。近年隨著對(duì)男性生殖領(lǐng)域的研究深入以及高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于NOA的病因及治療有了一些新的認(rèn)識(shí)。目前已發(fā)現(xiàn)許多非編碼RNA，如長(zhǎng)鏈非編碼RNAs（lncRNAs）、微小RNAs（miRNAs）、小干擾RNA（siRNA）、與Piwi蛋白相作用的RNA（piRNA）等參與雄性生殖的調(diào)節(jié)[2]。本文綜述lncRNAs與miRNAs在精子發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)與作用機(jī)制。

1 LncRNAs

1.1 LncRNAs概述及作用機(jī)制 LncRNAs占非編碼RNA的80%，為長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的調(diào)控性非編碼RNA，其可以是已知基因的反義轉(zhuǎn)錄物、內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄物，也可以轉(zhuǎn)錄自基因間隔區(qū)、假基因或轉(zhuǎn)座子等序列[3]。LncRNAs通過(guò)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾的表觀(guān)遺傳水平的多種機(jī)制調(diào)節(jié)基本的生化和細(xì)胞過(guò)程。主要作用方式包括：①lncRNAs可與轉(zhuǎn)錄因子相互作用以干擾轉(zhuǎn)錄；②lncRNAs可吸附miRNAs并阻止隨后的miRNAs對(duì)mRNA的抑制作用；③lncRNAs可直接與蛋白質(zhì)相互作用以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性，改變蛋白質(zhì)定位，或影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或組織作用；④lncRNAs可以募集染色質(zhì)修飾因子來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)修飾水平，然后影響基因的表達(dá)；⑤lncRNAs可直接與mRNA相互作用以抑制翻譯，調(diào)節(jié)可變剪接模式或影響mRNA的穩(wěn)定性[4]。LncRNAs具有空間、時(shí)間和系譜特異性，可通過(guò)其亞細(xì)胞定位確定的順式和反式作用機(jī)制參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。定位于細(xì)胞核中的lncRNAs參與表觀(guān)遺傳修飾和重復(fù)DNA元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄。此外，lncRNAs直接通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[5]。定位于細(xì)胞質(zhì)中的lncRNAs負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和相關(guān)的內(nèi)源性調(diào)節(jié)機(jī)制，這些競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）充當(dāng)miRNAs海綿或mRNA結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)者。此外，細(xì)胞質(zhì)中的lncRNAs可能參與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性加工，還可以與RNA結(jié)合蛋白（RBP）相互作用，調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6]。

1.2 LncRNAs與精子發(fā)生 從細(xì)胞水平來(lái)講，精子發(fā)生經(jīng)歷多個(gè)階段，包括精原干細(xì)胞增殖和分化、精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和成熟精子階段。從分子水平來(lái)講，精子發(fā)生的調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后翻譯、修飾等。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)lncRNAs在睪丸高度富集，并在精子發(fā)生中階段特異性地表達(dá)。Lü等[7]對(duì)NOA和正常睪丸內(nèi)lncRNAs的表達(dá)譜分析表明：在這兩種表型患者中分別有757個(gè)及2 370個(gè)lncRNAs表達(dá)下調(diào)，475個(gè)及163個(gè)lncRNAs表達(dá)上調(diào)。提示lncRNAs在精子發(fā)生不同階段的表達(dá)譜各異，且與哺乳動(dòng)物精子發(fā)生有著密切聯(lián)系。

LncRNAs已被確定為干細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。精原干細(xì)胞（SSCs）是獨(dú)特的雄性生殖系干細(xì)胞，支持精子發(fā)生。Li等[8]發(fā)現(xiàn)一種新的精原細(xì)胞特異性lncRNA，lncRNA033862是小鼠SSCs存活的必要條件，調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF），而GDNF是SSCs自我更新和存活所需的生長(zhǎng)因子。LncRNA033862是GDNF受體α1（Gfra1）的反義轉(zhuǎn)錄物，其缺乏編碼蛋白質(zhì)潛力并通過(guò)與Gfra1染色質(zhì)相互作用來(lái)調(diào)節(jié)Gfra1表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控SSCs的自我更新和存活。在敲低了lncRNA033862的SSCs中，其存活率明顯下降[8]。Hu等[9]發(fā)現(xiàn)lncRNA AK015322在小鼠SSCs中高表達(dá)；AK015322在體外促進(jìn)小鼠精原干細(xì)胞系C18-4的增殖。通過(guò)生物信息學(xué)分析、定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和雙熒光素酶測(cè)定，驗(yàn)證了lncRNA AK015322通過(guò)ceRNA作用與miR-19b-3p結(jié)合，拮抗miR-19b-3p功能，并減弱miR-19b-3p對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Ets差異基因5（ETV5）的抑制，而ETV5是SSCs自我更新的關(guān)鍵基因。

LncRNA Gm2044在小鼠精母細(xì)胞中豐富表達(dá)。未分化轉(zhuǎn)錄因子1（undifferentiated transcription factor 1，UTF1）是早期精原細(xì)胞的關(guān)鍵分子標(biāo)記，介導(dǎo)PTEN信號(hào)通路維持SSCs的功能[10]。LncRNA Gm2044可通過(guò)與Utf1 mRNA相互作用抑制相鄰精子發(fā)生相關(guān)基因Utf1的翻譯，影響精原細(xì)胞的分化及精母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程。此外，lncRNA Gm2044還可抑制小鼠精原細(xì)胞GC-1細(xì)胞系和精母細(xì)胞GC-2細(xì)胞系的增殖，表明lncRNA Gm2044具有調(diào)節(jié)精子發(fā)生中生殖細(xì)胞命運(yùn)的能力[11]。睪丸特異性lncRNA-HSVⅢ在粗線(xiàn)期精母細(xì)胞中表達(dá)，lncRNA-HSVⅢ與Prss42/Tessp-2的啟動(dòng)子相互作用，能增強(qiáng)Prss42/Tessp-2啟動(dòng)子的活性，Prss42/Tessp-2在粗線(xiàn)期精母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程中被特異性激活，其表達(dá)缺失將導(dǎo)致減數(shù)分裂被阻滯，細(xì)胞凋亡增加[12]。NLC1-C（narcolepsy candidate-region 1 genes C）是僅在精原細(xì)胞和早期精母細(xì)胞中表達(dá)的lncRNA，表明其可能在精子發(fā)生的早期階段發(fā)揮作用。NLC1-C在生精功能正常的生精小管中主要位于精原細(xì)胞和早期精母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而在生精功能降低的患者中，其主要位于精原細(xì)胞和早期精母細(xì)胞的細(xì)胞核中。NLC1-C過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而其低表達(dá)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并加速細(xì)胞凋亡[7]。微陣列分析發(fā)現(xiàn)，精子成熟阻滯（maturation arrest，MA）的NOA患者NLC1-C表達(dá)顯著下調(diào)。NLC1-C作為抑制因子通過(guò)與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的核仁蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)miR-320a和miR-383的表達(dá)，NLC1-C是 miR-320a和miR-383在人類(lèi)精子發(fā)生中的直接靶向標(biāo)記物。然而，當(dāng)NLC1-C在精原細(xì)胞核和睪丸中的初級(jí)精母細(xì)胞中積累，降低miR-320a和miR-383的表達(dá)時(shí)，導(dǎo)致男性不育[7]。

生長(zhǎng)停滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因7（growth arrestand DNA damage-inducible gene 7，gadd7） 是 一 種DNA損傷誘導(dǎo)型lncRNA。研究發(fā)現(xiàn)在精索靜脈曲張的患者中g(shù)add7表達(dá)上調(diào)，gadd7的相對(duì)表達(dá)水平與精子數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，過(guò)表達(dá)gadd7后GC-1和GC-2中細(xì)胞增殖受到抑制以及細(xì)胞凋亡增加，應(yīng)激誘導(dǎo)的gadd7可能通過(guò)上調(diào)促凋亡調(diào)節(jié)因子Bax和下調(diào)抗凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl2使精子生成過(guò)程受損導(dǎo)致男性不育[13]。精子特異性陽(yáng)離子通道蛋白1（Catsper1）僅在雄性生殖細(xì)胞中表達(dá)，該基因的啟動(dòng)子具有雙向轉(zhuǎn)錄活性，研究發(fā)現(xiàn)其上游啟動(dòng)子反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種名為Catsper1au的基因，Catsper1au是一種無(wú)內(nèi)含子和多腺苷酸化的lncRNA。在精子發(fā)生過(guò)程中表達(dá)的大多數(shù)基因在生精細(xì)胞的不同階段顯示出獨(dú)特的表達(dá)譜，而Catsper1au在精原細(xì)胞、粗線(xiàn)期精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞以及支持細(xì)胞中表達(dá)，在成熟精子中未見(jiàn)表達(dá)，表明了lncRNA-Catsper1au在精子發(fā)生過(guò)程中的作用[14]。

2 MiRNAs

2.1 MiRNAs概述及其作用機(jī)制 MiRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的新型單鏈小分子RNA，是一類(lèi)重要的非編碼RNA，通過(guò)堿基配對(duì)的方式與目標(biāo)mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）結(jié)合，并引起翻譯抑制和（或）mRNA降解來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)[15]。MiRNAs在物種中高度保守，并在多種生物過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括發(fā)育、分化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。MiRNAs在血漿、血清、精漿和其他體液中高度穩(wěn)定且豐富。MiRNAs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控已成為精子發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子，雄性生殖細(xì)胞中特異性缺失一種核糖核酸內(nèi)切酶DICER（miRNAs成熟過(guò)程中的關(guān)鍵酶類(lèi)），可導(dǎo)致精母細(xì)胞凋亡的增加、染色質(zhì)的缺陷以及精子細(xì)胞核形成的異常[16]。符梅等[17]通過(guò)對(duì)比NOA患者和生精功能正?；颊叩腄ICER基因的多態(tài)性及其等位基因，發(fā)現(xiàn)DICERrs3742330等位基因AA可能與男性無(wú)精癥有關(guān)。通過(guò)miRNAs的微陣列分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及siRNA序列分析技術(shù)，證實(shí)大量miRNAs高度且特異性表達(dá)于睪丸組織和睪丸內(nèi)某些特定類(lèi)型的生殖細(xì)胞中[18]。

2.2 MiRNAs與精子發(fā)生 Yao等[19]鑒定了梗阻性無(wú)精癥（OA）及NOA患者3種主要生精細(xì)胞（精原細(xì)胞、粗線(xiàn)期精子細(xì)胞及圓形精子細(xì)胞）的miRNAs表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在這3種細(xì)胞中miRNAs的數(shù)量及含量均有差異。RNA深度測(cè)序顯示，OA患者和NOA患者中396個(gè)miRNAs在人精原細(xì)胞中差異表達(dá)，395個(gè)miRNAs在人粗線(xiàn)期精母細(xì)胞中差異表達(dá)，378個(gè)miRNAs在人圓形精子細(xì)胞中差異表達(dá)；通過(guò)生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)幾種差異表達(dá)的miRNAs：hsa-mir-99b-5p/hsa-mir-99a-5p/hsa-mir-100-5p與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3（FGFR3），hsa-mir-143-3p與SMAD3，hsa-mir-145-5p與刺激蛋白1（SP1），hsalet-7e-5p與TGFBR1，hsa-mir-424-5p與AKT3有結(jié)合位點(diǎn)。FGFR3是FGF2的受體，已證明其對(duì)SSCs的存活和增殖至關(guān)重要。FGFR3的表達(dá)僅限于人類(lèi)睪丸中的A型精原細(xì)胞，表明FGF2/FGFR3信號(hào)通路可能參與人類(lèi)精原細(xì)胞的自我更新和（或）分化。信號(hào)通路蛋白SMAD3屬于SMAD超家族成員，其可以激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β），對(duì)精子發(fā)生有重要作用。SP1調(diào)節(jié)Sohlh1基因轉(zhuǎn)錄，這是早期精子發(fā)生過(guò)程中精原細(xì)胞分化所必需的。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體1（TGFBR1）存在于大鼠和公豬睪丸的粗線(xiàn)期精母細(xì)胞中，但在長(zhǎng)型精子細(xì)胞中不存在，提示TGFBR1可能參與減數(shù)分裂的控制。此外，AKT3是磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶（PI3K-AKT）通路的成員，激活該通路對(duì)于維甲酸誘導(dǎo)精原細(xì)胞分化的Stra8表達(dá)至關(guān)重要[19]。

Lian等[20]通過(guò)微陣列技術(shù)分析NOA患者和正常對(duì)照者的睪丸組織miRNAs差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)NOA患者154個(gè)miRNAs差異表達(dá)下調(diào)，19個(gè)表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步鑒定了NOA患者中幾種下調(diào)的miRNAs，例如miR-17-92和miR-371，miR-2，miR-3在NOA患者中低表達(dá)，而miR-17-92和miR-372/miR-373可下調(diào)凋亡基因并可能抑制細(xì)胞凋亡；NOA患者這些miRNAs的下調(diào)可能會(huì)引起細(xì)胞凋亡的增加，進(jìn)而參與NOA的發(fā)生。

Marcon等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-188-3p在人睪丸組織的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中表達(dá)豐富，且可在小鼠細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)檢測(cè)到。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-188-3p在NOA中顯著下調(diào)，通過(guò)調(diào)控其靶基因DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白1（MLH1）導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡[22]。Xu等[23]驗(yàn)證了miR-188-3p是小鼠睪丸內(nèi)聚嘧啶束結(jié)合蛋白2（PTBP）的靶點(diǎn)，而PTBP2通過(guò)與生殖細(xì)胞特異性磷酸甘油酸激酶2的3′-UTR區(qū)結(jié)合，提示miR-188-3p可能是調(diào)控PTBP2參與精子發(fā)生的另一潛在通路。

NOA患者行顯微睪丸取精術(shù)（microdissection testicular spermextraction，micro-TESE）時(shí)，從取出精子和未取出精子的睪丸組織中鑒定出180種差異表達(dá)的miRNAs。未取出精子組中13種miRNAs表達(dá)上調(diào)，167種miRNAs表達(dá)下調(diào)，其中有86種miRNAs表達(dá)缺失，但在取出精子組中表現(xiàn)出高表達(dá)，表明這些miRNAs在精子發(fā)生中可能起重要作用，或許可作為判斷micro-TESE時(shí)能否取出精子的標(biāo)志物[24]。Wu等[25]發(fā)現(xiàn)NOA患者的miR-34b/c和miR-449a在雄性生殖細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著降低。MiR-34b/c和miR-449a具有相似的堿基序列，因此其對(duì)調(diào)節(jié)精子發(fā)生具有相同的作用。在小鼠中，miR-34b/c和miR-449a的單個(gè)敲除對(duì)精子發(fā)生沒(méi)有影響；而miR-34b/c和miR-449a的同時(shí)失活可導(dǎo)致雄性小鼠不育。

3 LncRNAs與miRNAs的相互作用

3.1 LncRNAs調(diào)節(jié)miRNAs Salmena等[26]提出競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA假說(shuō)，其中包括具有miRNA反應(yīng)元件（microRNA response elements，MRE）的ceRNA可通過(guò)與細(xì)胞中的MRE結(jié)合來(lái)阻斷靶miRNAs的功能。作為最重要的細(xì)胞內(nèi)ceRNA之一，lncRNAs可通過(guò)與MRE吸附靶miRNAs，并抑制由miRNAs介導(dǎo)的靶向mRNA降解。這也是lncRNAs參與的常見(jiàn)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制之一[27]。

LncRNAs在基因表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮復(fù)雜功能，并且還可以作為前體或支架起作用。因此，作為miRNAs前體，lncRNAs可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)RNA剪接產(chǎn)生特異性miRNAs并增強(qiáng)靶mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[28]。研究表明，RNA polⅡ轉(zhuǎn)錄的lncRNA-H19不僅可充當(dāng)分子海綿調(diào)節(jié)let-7，還可作為前體通過(guò)RNA剪接產(chǎn)生兩種成熟的miRNAs，miR-675-5p和miR-675-3p[28-29]。

LncRNAs含有識(shí)別元件，其結(jié)構(gòu)、功能與miRNAs類(lèi)似，通過(guò)與miRNAs競(jìng)爭(zhēng)特異性識(shí)別靶向mRNA的3′-UTR，可以抑制miRNAs對(duì)靶mRNA的負(fù)調(diào)節(jié)。

3.2 MiRNAs調(diào)節(jié)lncRNAs LncRNAs在其轉(zhuǎn)錄過(guò)程中類(lèi)似于mRNA且具有結(jié)構(gòu)相似性。因此，除了靶向mRNA外，RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中的miRNAs還可以通過(guò)不完全堿基互補(bǔ)配對(duì)調(diào)節(jié)靶l(wèi)ncRNAs，并降低其結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性[30]。

MiRNAs還可以通過(guò)某些機(jī)制增強(qiáng)lncRNAs的表達(dá)。研究表明，成熟的細(xì)胞質(zhì)miRNAs可以進(jìn)入細(xì)胞核并調(diào)節(jié)mRNA和非編碼RNA的核轉(zhuǎn)錄。例如，脂肪來(lái)源的干細(xì)胞中的成熟miR-140通過(guò)與NEAT1基因的974-998bp和2370-2403bp位點(diǎn)的特異性結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核，并顯著促進(jìn)NEAT1的基因表達(dá)以及改善其核穩(wěn)定性[31]。

4 結(jié)語(yǔ)

LncRNAs及miRNAs在精子發(fā)生的各個(gè)階段都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。目前對(duì)于NOA患者lncRNAs及miRNAs的功能研究尚少，通過(guò)對(duì)不同生精功能的睪丸組織及參與精子發(fā)生各階段的細(xì)胞中差異表達(dá)lncRNAs和miRNAs的分析，將有助于深入研究非編碼RNA在精子發(fā)生中涉及的機(jī)制，同時(shí)還可以從lncRNAs與miRNAs在NOA中相互調(diào)控方面去發(fā)現(xiàn)更多新的涉及精子發(fā)生的機(jī)制。