基于離子遷移譜的肌酐檢測(cè)研究

高曉光何秀麗賈建李建平

(1.中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100190；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

肌酐是人體肌肉組織代謝的產(chǎn)物。肌肉中肌酸主要通過(guò)不可逆的非酶脫水反應(yīng)緩慢形成肌酐，再釋放到血液中。血清肌酐(Serum creatinine，Scr)與體內(nèi)肌肉總量關(guān)系密切，不易受飲食影響。人體中的肌酐主要由腎小球?yàn)V過(guò)排出體外。在正常條件下，肌酐濃度相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)腎臟機(jī)能受到損傷時(shí)，肌酐的正常排泄功能受到一定阻礙，Scr濃度升高。腎功能正常者的Scr濃度小于133 μmol/L，而尿毒癥患者的Scr濃度一般大于707 μmol/L。Scr濃度是臨床上計(jì)算腎小球?yàn)V過(guò)率(glomerular filtration rate, GFR)，評(píng)價(jià)腎功能的重要指標(biāo)。檢測(cè)Scr對(duì)慢性腎臟病等疾病的發(fā)現(xiàn)和治療具有重要意義[1]。

臨床上主要通過(guò)堿性苦味酸法和酶法(包括肌氨酸氧化酶法與肌酐亞胺水解酶法)測(cè)定Scr[2, 3]，堿性苦味酸法成本低廉，但特異性不強(qiáng)，抗干擾能力差；肌氨酸氧化酶法準(zhǔn)確度、抗干擾能力均優(yōu)于堿性苦味酸法，并且交叉污染較少，適用于全自動(dòng)生化分析儀，但檢測(cè)成本較高，測(cè)得的Scr值容易受到血管保護(hù)劑類藥物羥苯磺酸鈣和維生素類藥物維生素C等的干擾[4 - 6]。我國(guó)于2013年頒布了衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《血清肌酐測(cè)定參考方法. 同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》(WS/T413—2013)，規(guī)定同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法為Scr測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法[7]。除此之外，肌酐檢測(cè)方法還包括毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、拉曼散射法等，但這些不適合大規(guī)?，F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，只適合實(shí)驗(yàn)室中校準(zhǔn)對(duì)照或高精度檢測(cè)[3]。

離子遷移譜(Ion Mobility Spectrometry，IMS)基于不同氣相離子在電場(chǎng)中遷移速度的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)化學(xué)物質(zhì)的分離檢測(cè)。與其它方法相比，IMS具有分析速度快、檢測(cè)限低、不需要真空環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[8]。IMS已被廣泛應(yīng)用于人體健康檢測(cè)研究中，如許多研究人員使用IMS檢測(cè)人體呼出氣體或尿樣、血樣中的特定組分，區(qū)分某些疾病患者與健康人，實(shí)現(xiàn)疾病的早期發(fā)現(xiàn)與診斷[9]。

本實(shí)驗(yàn)使用實(shí)驗(yàn)室自制的電暈放電離子遷移譜(CD-IMS)系統(tǒng)進(jìn)行肌酐檢測(cè)研究，根據(jù)IMS圖譜中被測(cè)物特征離子峰強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)肌酐的定量測(cè)量，并探討了羥苯磺酸鈣、維生素C等藥物對(duì)肌酐IMS檢測(cè)的干擾。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

肌酐(CAS：60-27-5)：99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羥苯磺酸鈣(CAS：20123-80-2)：99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；維生素C(CAS：50-81-7)：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；封口玻璃毛細(xì)管：內(nèi)徑0.9～1.1 mm，壁厚0.10～0.15 mm，管長(zhǎng)100 mm，華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠；去離子水：電阻率18.2MΩ·cm。

1.2 離子遷移譜實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)及原理

圖1為CD-IMS實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。整個(gè)系統(tǒng)由漂移管和維持漂移管正常工作的輔助設(shè)備組成。

圖1 CD-IMS實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

漂移管為CD-IMS實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)核心部件，主要包括離化區(qū)和漂移區(qū)兩部分，兩者由Bradbury-Nielson型離子門隔開(kāi)。漂移管由不銹鋼漂移環(huán)和聚四氟乙烯絕緣環(huán)交替重疊組成，漂移電壓通過(guò)電阻分壓后加在各漂移環(huán)上，在漂移管內(nèi)形成均勻漂移電場(chǎng)。漂移管末端為法拉第盤，用于離子流信號(hào)收集檢測(cè)。在漂移管前端離化區(qū)入口處的不銹鋼電暈針與漂移管第一級(jí)漂移環(huán)構(gòu)成“針-環(huán)”結(jié)構(gòu)的電暈放電電離源。在離化區(qū)入口處另有通孔分別作為進(jìn)樣口與漂移氣出口。

輔助設(shè)備包括溫控模塊、漂移氣路、離子流信號(hào)放大與數(shù)據(jù)采集處理裝置以及用于電離源及漂移電場(chǎng)的高壓電源等。漂移氣路包括空氣源(A-10型，北京中惠普分析技術(shù)研究所)、干燥凈化管以及管路?？諝庠串a(chǎn)生的潔凈空氣經(jīng)活性炭與分子篩干燥凈化后從法拉第盤周圍導(dǎo)入漂移管作為漂移氣體。整個(gè)漂移管置于恒溫裝置中，由溫控模塊調(diào)控漂移管工作溫度。受材料限制，漂移管最高工作溫度為200℃。

被測(cè)物分子在離化區(qū)與空氣電暈放電產(chǎn)生的反應(yīng)離子相互作用生成被測(cè)物特征離子，通過(guò)離子門進(jìn)入漂移區(qū)，然后在電場(chǎng)作用下漂移到末端法拉第盤。pA級(jí)的離子流信號(hào)經(jīng)放大后轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)并上傳到上位機(jī)，由上位機(jī)實(shí)現(xiàn)IMS譜圖的顯示、分析及存儲(chǔ)。通過(guò)IMS譜圖中離子峰的變化確定被測(cè)物特征離子峰，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)被測(cè)物的定性定量檢測(cè)。

IMS實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的主要參數(shù)如表1所示。

表1 CD-IMS實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)主要參數(shù)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

使用電子天平(GR-202型，日本AND)稱量一定量肌酐固體，溶于去離子水中得到1 g/L(8840 μmol/L)的肌酐母液，之后取母液用去離子水按照一定比例稀釋即可得到一系列濃度的肌酐樣品。

將封口玻璃毛細(xì)管加熱，用移液器移取2 μL肌酐樣品，在封口玻璃毛細(xì)管冷卻過(guò)程中沿開(kāi)口端注入封口玻璃毛細(xì)管中。由于氣體熱脹冷縮，肌酐樣品完全進(jìn)入毛細(xì)管中，進(jìn)樣時(shí)將封口玻璃毛細(xì)管開(kāi)口端沿進(jìn)樣口插入IMS系統(tǒng)，避免了樣品與進(jìn)樣口內(nèi)壁接觸造成損耗和污染。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)玻璃毛細(xì)管的插入位置及漂移管溫度會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，通過(guò)參數(shù)優(yōu)化確定最優(yōu)的玻璃毛細(xì)管進(jìn)樣位置和漂移管溫度。

采集從進(jìn)樣到產(chǎn)物離子峰消失全過(guò)程的IMS譜圖，根據(jù)譜圖中肌酐特征離子峰的漂移時(shí)間計(jì)算肌酐的約化遷移率。為減小漂移氣以及環(huán)境中的痕量雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，采用肌酐響應(yīng)圖譜與空白譜的差分譜中肌酐特征離子峰最大高度作為IMS對(duì)肌酐響應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度。檢測(cè)不同濃度肌酐樣品，得到肌酐的響應(yīng)—濃度曲線、線性范圍與檢測(cè)限。

采用同樣方法配制羥苯磺酸鈣與維生素C樣品并進(jìn)行IMS檢測(cè)，獲得高濃度羥苯磺酸鈣與維生素C樣品的IMS譜圖；分別配制肌酐與羥苯磺酸鈣、維生素C的混合樣品，研究羥苯磺酸鈣與維生素C對(duì)肌酐IMS檢測(cè)的干擾情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 肌酐的IMS檢測(cè)圖譜

圖2為空白圖譜及4.42 μmol/L肌酐樣品CD-IMS檢測(cè)時(shí)得到的系列譜圖，其中(a)為空白譜圖，(b)、(c)和(d)分別為進(jìn)樣后8s、62s、79s的譜圖。

圖2 空白圖譜及肌酐的系列CD-IMS譜圖(a).空白譜 ；(b).進(jìn)樣后8s；(c).進(jìn)樣后62s；(d).進(jìn)樣后79s漂移管溫度：200℃ ； 進(jìn)樣距離：5cm

圖2(a)空白譜圖中，RIP1，RIP2，RIP3為反應(yīng)物離子峰，利用四丁基溴化銨標(biāo)定[10]后計(jì)算其約化遷移率分別為3.09cm2·V-1·s-1，2.69cm2·V-1·s-1和2.40cm2·V-1·s-1，可知其分別為(NH4)+(H2O)n，(NO)+(H2O)n和(H3O)+(H2O)n，其中n的數(shù)值與漂移氣中的水含量及漂移管溫度有關(guān)[11]。

將玻璃毛細(xì)管插入進(jìn)樣口之后，由于肌酐的沸點(diǎn)(184.3±23.0℃)較高，而且常溫下蒸汽壓很小(25℃時(shí)0.2±0.8 mmHg)，在漂移管高溫作用下樣品中水首先汽化，漂移氣體中水含量增加，導(dǎo)致IMS譜圖中RIP1離子峰增大，RIP2離子峰減小直至消失。在水的汽化過(guò)程中(持續(xù)時(shí)間約55～60s)，漂移管中水汽濃度基本維持不變，IMS譜圖也保持如圖2(b)所示基本不變。

樣品中水完全汽化后，肌酐通過(guò)蒸發(fā)或升華過(guò)程逐漸變成氣體，在IMS圖譜中出現(xiàn)漂移時(shí)間為11.04ms的新離子峰，如圖2(c)所示。同時(shí)由于漂移氣體中水汽含量降低，RIP2峰重新出現(xiàn)。比較相同條件下去離子水的IMS譜圖，可以知道漂移時(shí)間為11.04ms的離子峰為肌酐特征離子峰。由于肌酐分子中含有易于結(jié)合質(zhì)子的胺類官能團(tuán)，易與質(zhì)子結(jié)合形成[M+H]+(m/z 114)的分子離子[12]，推測(cè)圖2(c)中肌酐的特征離子為質(zhì)子化的水合離子[M+H]+(H2O)n，計(jì)算其約化遷移率為1.83cm2·V-1·s-1，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的約化遷移率(1.86～1.89 cm2·V-1·s-1)基本一致。

樣品中肌酐完全變?yōu)闅怏w后，在漂移氣的清潔作用下離化區(qū)中肌酐濃度逐漸降低，其特征峰強(qiáng)度逐漸降低，到79s左右時(shí)基本消失，譜圖見(jiàn)圖2(d)。

2.2 IMS漂移管溫度及玻璃毛細(xì)管進(jìn)樣位置優(yōu)化

不同漂移管溫度下4.42 μmol/L肌酐的CD-IMS信號(hào)強(qiáng)度如圖3所示。

圖3 不同漂移管溫度下肌酐CD-IMS信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)樣距離：5cm

可以看出在160℃到200℃范圍內(nèi)，肌酐信號(hào)強(qiáng)度隨漂移管溫度的提高而逐漸增大。這主要是因?yàn)楦叩钠乒芄ぷ鳒囟扔兄诩◆目焖僬舭l(fā)或升華，從而在離化區(qū)獲得更高濃度的肌酐氣體及更大的響應(yīng)信號(hào)。下文實(shí)驗(yàn)中漂移管工作溫度保持為200℃。

玻璃毛細(xì)管的進(jìn)樣位置(玻璃毛細(xì)管開(kāi)口端插入進(jìn)樣口的距離)對(duì)肌酐的CD-IMS信號(hào)強(qiáng)度有較大影響。圖4是不同玻璃毛細(xì)管進(jìn)樣位置下肌酐的CD-IMS信號(hào)強(qiáng)度。當(dāng)玻璃毛細(xì)管進(jìn)入進(jìn)樣口深度小于5cm時(shí)，毛細(xì)管開(kāi)口位于CD電暈針尖前方(電暈針尖與漂移氣出口之間)，樣品中的大部分肌酐分子在漂移氣作用下被直接吹出漂移管，未能形成離子，導(dǎo)致肌酐特征峰信號(hào)很小。當(dāng)玻璃毛細(xì)管進(jìn)入進(jìn)樣口深度為5cm時(shí)，毛細(xì)管開(kāi)口處與CD電暈針尖基本齊平，在CD放電區(qū)域可以獲得較高的肌酐分子濃度，從而得到較大的肌酐信號(hào)。當(dāng)玻璃毛細(xì)管進(jìn)入進(jìn)樣口深度超過(guò)5cm時(shí)，玻璃毛細(xì)管開(kāi)口處位于CD電暈針后方(電暈針與第一級(jí)漂移管之間)，毛細(xì)管外壁積累的表面電荷對(duì)電暈放電產(chǎn)生較大影響；而且毛細(xì)管開(kāi)口處與CD電暈針尖距離增大也導(dǎo)致放電區(qū)域肌酐分子濃度降低，這些都導(dǎo)致了肌酐信號(hào)的減小。

圖4 不同玻璃毛細(xì)管進(jìn)樣位置下肌酐CD-IMS信號(hào)強(qiáng)度漂移管溫度：200℃

2.3 肌酐樣品的IMS檢測(cè)

配制一系列濃度的肌酐樣品，在優(yōu)化后的工作參數(shù)下對(duì)每個(gè)濃度樣品進(jìn)行12次檢測(cè)，得到肌酐的CD-IMS響應(yīng)-濃度曲線如圖5所示。

圖5 肌酐CD-IMS響應(yīng)-濃度曲線

肌酐在0.88 μmol/L ～ 8.80 μmol/L范圍內(nèi)線性回歸方程為y=0.03874x+0.00712，相關(guān)系數(shù)R2=0.98，基于3倍噪聲計(jì)算的檢測(cè)限(Limit of Detection，LOD)為0.087 μmol/L，遠(yuǎn)低于健康人的Scr值。

2.4 羥苯磺酸鈣和維生素C對(duì)肌酐檢測(cè)的影響

圖6為羥苯磺酸鈣、維生素C樣品以及它們與肌酐混合樣品的CD-IMS譜圖，其中(a)、(b)分別為高濃度羥苯磺酸鈣與維生素C樣品的CD-IMS譜圖，而(c)、(d)為肌酐分別與羥苯磺酸鈣、維生素C混合樣品的CD-IMS譜圖。

圖6 羥苯磺酸鈣、維生素C以及與肌酐混合樣品的CD-IMS譜圖(a).4780 μmol/L羥苯磺酸鈣；(b) .567 μmol/L維生素C；(c).4.42 μmol/L肌酐 +1.20 μmol/L羥苯磺酸鈣；(d). 4.42 μmol/L肌酐 + 4.19 μmol/L維生素C

由圖6(a)可見(jiàn)，羥苯磺酸鈣IMS圖譜10.74ms處出現(xiàn)一強(qiáng)度較弱的特征峰，其約化遷移率為1.88 cm2·V-1·s-1，與肌酐的約化遷移率不同。圖6(b)維生素CIMS圖譜在12.19 ms處有一較弱特征峰a，12.80ms處有一較強(qiáng)特征峰b，約化遷移率分別為1.66 cm2·V-1·s-1和1.58 cm2·V-1·s-1，均與肌酐的約化遷移率不同。維生素C具有較強(qiáng)的還原性，其水溶液不穩(wěn)定，容易被氧化成脫氫維生素C，在正離子模式下的IMS譜圖中可見(jiàn)較強(qiáng)的特征離子峰。

圖6(c)、(d)樣品分別為4.42 μmol/L肌酐和1.20 μmol/L羥苯磺酸鈣混合溶液、4.42 μmol/L肌酐和14.19 μmol/L維生素C混合溶液。這是因?yàn)楦鶕?jù)文獻(xiàn)[4]報(bào)道，當(dāng)按照建議劑量服用羥苯磺酸鈣藥品時(shí)，體內(nèi)血清羥苯磺酸鈣濃度將會(huì)穩(wěn)定在15 mg/L(35.85 μmol/L)以下，其濃度量級(jí)與Scr相當(dāng)。正常人體血漿中維生素C含量在4mg/L(9.56 μmol/L)以上，其濃度量級(jí)同樣與Scr相當(dāng)。從圖6(c)、(d)可以看出混合樣品的譜圖中除了肌酐的特征離子峰和反應(yīng)物離子峰外，沒(méi)有出現(xiàn)其它明顯的干擾峰。

對(duì)兩種混合樣品分別進(jìn)行6次重復(fù)檢測(cè)，與肌酐樣品的CD-IMS響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行比較。4.42 μmol/L肌酐樣品的IMS信號(hào)強(qiáng)度為0.183±0.019 a.u.，肌酐與羥苯磺酸鈣混合樣品的IMS信號(hào)強(qiáng)度為0.163±0.046a.u.，與肌氨酸氧化酶法相比本方法中羥苯磺酸鈣對(duì)肌酐檢測(cè)的負(fù)干擾較?。患◆c維生素C混合樣品的IMS信號(hào)強(qiáng)度為0.175±0.016a.u.，與肌酐樣品信號(hào)強(qiáng)度基本相當(dāng)，可見(jiàn)維生素C對(duì)于肌酐的IMS檢測(cè)影響很小。

肌酐的肌氨酸氧化酶檢測(cè)法是通過(guò)檢測(cè)肌酐在酶作用下降解產(chǎn)生的H2O2濃度來(lái)確定肌酐濃度，羥苯磺酸鈣、維生素C等可消耗H2O2，從而對(duì)肌酐檢測(cè)產(chǎn)生負(fù)干擾。而在IMS檢測(cè)方法中，由于肌酐含有胺類官能團(tuán)，很容易形成正離子，羥苯磺酸鈣、維生素C等對(duì)肌酐與反應(yīng)離子之間的分子離子反應(yīng)影響較小，從而對(duì)肌酐的IMS檢測(cè)干擾較小。IMS可作為肌氨酸氧化酶法的補(bǔ)充用于肌酐檢測(cè)。

3 結(jié)論

利用自制CD-IMS系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)肌酐樣品檢測(cè)，線性范圍0.88 μmol/L～ 8.80 μmol/L，基于3倍噪聲的檢測(cè)限為0.087 μmol/L。對(duì)肌酐和羥苯磺酸鈣、維生素C的混合樣品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)羥苯磺酸鈣、維生素C對(duì)肌酐的IMS檢測(cè)影響很小。IMS方法操作簡(jiǎn)便，在肌酐的快速檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。