劉亞欣 曲宏博 項(xiàng) 祎

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新免疫實(shí)驗(yàn)，河北 保定 071000）

口蹄疫（foot- -and- mouth disease，F(xiàn)MD），又稱口瘡熱，是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄類動(dòng)物共思的急性、熱性、接觸性傳染病，也是人畜共患的傳染病。主要感染牛、豬、羊、駱駝等家畜及野生的偶蹄類動(dòng)物。[2]在過去的幾百年里，F(xiàn)MD弱毒疫苗和滅活疫苗在預(yù)防和控制FMD的過程中發(fā)揮著重要作用，但同時(shí)也存在疫苗株毒力返強(qiáng)，病毒逃逸或滅活不徹底等危險(xiǎn)。

病毒必須進(jìn)入宿主細(xì)胞，到達(dá)細(xì)胞內(nèi)的特定區(qū)域才能啟動(dòng)并完成自我復(fù)制，通常 DNA 病毒需要進(jìn)入細(xì)胞核，而RNA 病毒需要到達(dá)細(xì)胞核周的區(qū)域。[3]新型疫苗的研究過程中發(fā)現(xiàn)病毒與宿主細(xì)胞的相互作用是復(fù)雜的，其中，F(xiàn)MDV編碼的L pro在抗宿主先天性免疫方面發(fā)揮著重要作用，包括轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平。L pro通過切割宿主的eIF4G，關(guān)閉宿主帽子依賴的翻譯，影響細(xì)胞因子的翻譯和主要組織相容性復(fù)合體的表達(dá)，在機(jī)體產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)之前，快速利用宿主的原料合成出大量的子代病毒。[4]

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

RPMI-1640完全細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。三蒸水，75%酒精，1.8%生理鹽水均由本實(shí)驗(yàn)室配制保存。PBS購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。ConA購(gòu)自 Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 ELISA

動(dòng)物干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司。

1.2 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

于超凈臺(tái)內(nèi)將清潔級(jí)小鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡5分鐘，用紗布吸干小鼠體表的酒精，嚴(yán)格按照無菌操作的要求。

在小鼠左腹側(cè)中部剪開小口取出脾臟。用生理鹽水漂洗一次， 放于含有3mL RPM1-1640完全細(xì)胞培養(yǎng)基的平皿。在脾兩端剪一小口，將淋巴細(xì)胞吹出來，直至脾發(fā)白。收集平皿中的細(xì)胞液至4mL離心管中，離心2000r/min，5 min，棄上清。加入1mL三蒸水30-40s左右裂解紅細(xì)胞，再用等量1.8%生理鹽水調(diào)至等滲，離心2000r/min，5min，棄上清。最后將沉淀細(xì)胞用100μIRPMI-1640完全細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，取20μl進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且用等量臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)活性細(xì)胞百分比（活細(xì)胞數(shù)大于97%）。將剩下的細(xì)胞懸液用細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整成2.5×106/mL的脾細(xì)胞懸液，從配好的懸液里取400μl到1.5mL離心管中，加入3.2μL的ConA，分4個(gè)孔，每孔100μL； 再取400μL懸液到1.5mL離心管中，加入3.2μL的完全細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸夜加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37"C， 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，每天搖動(dòng)。培養(yǎng)結(jié)束前4h，于培養(yǎng)板中加入1μg/μl CCK-8液，10μL/孔， 繼續(xù)培養(yǎng)至所需時(shí)，用讀板機(jī)在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定A值。

1.3 ELASA試驗(yàn)

（1）使用前，將所有試劑充分混勻，避免產(chǎn)生泡沫。

（2）確定所需的板條數(shù)目。樣本（含標(biāo)準(zhǔn)品）和空白都應(yīng)做復(fù)孔。

（3）加樣：在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入100μl稀釋后的Cytokine standard （細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)） ，在樣本孔中加入100μl樣品，在空白對(duì)照孔中加入100μl Dilution bufferR（1 x） （稀釋液R ）。

（4）加檢測(cè)抗體：每孔加入50μl Biotinylated antibody （生物素基化的抗體）工作液。混勻后，蓋上封板膜，37℃溫育90分鐘。

（5）洗板：扣去孔內(nèi)液體，每孔加入300μl 1xWashing buffer（洗滌緩沖液）工作液。停留1分鐘后棄去孔內(nèi)液體。重復(fù)4次，每一次在濾紙上扣干。

（6）加酶： 每孔加入100μl Streptavidin-HRP （鏈霉親和素）工作液。蓋上封板膜，37℃溫育30分鐘。

（7）洗板：重復(fù)步驟5。

（8）顯色：每孔加入100μl TMB （過氧化酶的新底物），37 °C避光溫育5-30分鐘，根據(jù)孔內(nèi)顏色的深淺（深藍(lán)色）來判定終止反應(yīng)。通常顯色10-20分鐘可以達(dá)到很好的效果。

（9）終止反應(yīng)：每孔迅速加入100μl Stop solution （停止液）終止反應(yīng)。

（10）讀板：終止后10分鐘內(nèi)，用檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm讀值。

1 2 3 4 5 6 7 5 9 10 11 12 A 0.704 O.672 0.627 0.626 0.593 0.652 0.615 0.649 0.625 0.666 1.063 O.654 B 0.655 0.514 0.716 0.629 0.046 0.046 0.245 0.544 0.045 0.046 0.216 0.655 C 0.716 0.652 0.642 0.714 0.045 0.046 0.235 0.519 0.047 0.047 0.047 0.750 D 0.699 0.515 0.359 0.356 0.046 0.045 0.237 0.475 0.046 0.045 0.046 0.745 E 0.599 0.510 0.252 0.259 0.047 0.045 0.235 0.443 0.046 0.047 0.201 0.705 F 0.673 0.232 0.530 0.654 0.046 0.047 0.225 0.539 0.047 0.047 0.050 0.543 G 0.653 0.444 0.446 0.569 0.046 0.046 0.245 0.459 0.046 0.046 0.045 0.624 H 0.923 0.655 0.772 0.705 0.732 0.705 0.725 0.716 0.716 0.733 0.955 0.769

2 結(jié)果

2.1 鑒定口蹄疫病毒樣顆粒疫苗能誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞增殖

實(shí)驗(yàn)顯示未加人刺激物培養(yǎng)的對(duì)照組中除少量自增殖外，沒有發(fā)生明顯的增殖改變。而加人ConA共同培養(yǎng)的刺激組細(xì)胞則發(fā)生了顯著的增殖，實(shí)驗(yàn)組隨著濃度的增加吸光度A值增大，這個(gè)結(jié)果說明了這個(gè)生長(zhǎng)因子具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

2.2 口蹄疫樣顆粒刺激小鼠產(chǎn)生更多的外周血細(xì)胞因子

為了驗(yàn)證病毒樣顆粒如何刺激小鼠產(chǎn)生更多的外周血細(xì)胞因子，在每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔加入100 μl稀釋后的Cytokine standard （細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)） ，每個(gè)樣品孔加入100 μl樣本，每個(gè)空白對(duì)照孔加入100 μl Dilution bufferR（1 x） （稀釋液R ）。加生物素基化的抗體、鏈霉親和素后，實(shí)驗(yàn)顯示外周血細(xì)胞因子增多。

對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組

3 討論

口蹄疫的多血清型及型間無交叉保護(hù)，為口蹄疫的控制帶來巨大困難。在新型疫苗進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用前，還需對(duì)此類疫苗的免疫機(jī)制和分子生物學(xué)特性作更深入地研究。[5]已有研究表明口蹄疫病毒樣顆粒疫苗能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，抑制FMDV VLPs在機(jī)體內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖。那么闡明口蹄疫病毒樣顆粒疫苗對(duì)機(jī)體免疫機(jī)制的增強(qiáng)作用，則有利于對(duì)FMD進(jìn)行有效的防控提供科學(xué)依據(jù)。本文首先驗(yàn)證出，口蹄疫病毒樣顆粒疫苗能刺激淋巴細(xì)胞分化，之后通過ELIS A實(shí)驗(yàn)得出該疫苗能剌激機(jī)體產(chǎn)生更多的外周血細(xì)胞因子，從而調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫。

4 結(jié)論

口蹄疫病毒樣顆粒疫苗能刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞分化，同時(shí)使機(jī)體產(chǎn)生更多的記憶細(xì)胞，分泌更多IFN-γ。由此可知，口蹄疫病毒樣顆粒疫苗能夠通過刺激淋巴細(xì)胞分化來增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答功能，并且使機(jī)體產(chǎn)生更多的記憶細(xì)胞來應(yīng)對(duì)FMDV VLPs二次感染機(jī)體，同時(shí)使機(jī)體分泌更多IFN-γ以抑制FMDV VLPs在機(jī)體內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖。