董潤(rùn)楠，宋志英，王文淵

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是指當(dāng)腹壓增加，如大笑、咳嗽、打噴嚏、行走、搬重物等的時(shí)候，在膀胱逼尿肌未收縮的情況下，患者出現(xiàn)尿液漏出且不能自行控制，嚴(yán)重影響患者的正常生活、工作、社交和兩性關(guān)系，威脅婦女軀體、心理和社會(huì)等方面的健康?；谂璧渍w理論和吊床理論，SUI的發(fā)生與肛提肌的損傷密切相關(guān)。機(jī)械生長(zhǎng)因子（mechano growth factor，MGF）是骨骼肌損傷后局部微環(huán)境中表達(dá)迅速上調(diào)的一種生長(zhǎng)因子，發(fā)揮修復(fù)再生作用的具體機(jī)制不清。本研究通過(guò)檢測(cè)女性SUI患者及直腸癌根治術(shù)患者肛提肌成肌細(xì)胞的存活率及層黏連蛋白（Laminin）、肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白（Dystrophin）的表達(dá)情況，初步探索MGF對(duì)SUI治療作用的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 MGF購(gòu)自上海近岸蛋白質(zhì)科技有限公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT）購(gòu)自上海吉爾生化有限公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)自上海舜冉生物科技有限公司，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司，兔抗橫紋肌輔肌動(dòng)蛋白抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、總RNA提取試劑盒、超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。倒置三目生物顯微鏡購(gòu)自上海領(lǐng)成生物科技有限公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自上海皓莊儀器有限公司，熒光顯微鏡、CFX Connect實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀購(gòu)自上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，離心機(jī)購(gòu)自常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司，臺(tái)式空氣恒溫振蕩器購(gòu)自太倉(cāng)市華美生化儀器廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)取材 選擇2016—2017年于山西省婦幼保健院婦產(chǎn)科診斷為SUI并行盆底修復(fù)手術(shù)的患者1例，術(shù)中鉗夾3～4塊5 mm×5 mm×5 mm肛提肌組織，液氮罐中保存。選擇同期于山西省腫瘤醫(yī)院診斷為低位直腸癌并行經(jīng)腹會(huì)陰聯(lián)合根治術(shù)的患者1例，同法取得肛提肌活檢標(biāo)本。

1.2.2 肛提肌成肌細(xì)胞分離培養(yǎng) 將肛提肌活檢標(biāo)本剪成1 mm3的碎塊，Hanks液沖洗3次。往碎塊中加入按1∶1混合的膠原酶（0.1%）和胰蛋白酶（0.25%），消化2次（37℃，30 min/次）。取第2次消化所得的細(xì)胞懸液，加入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化。移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。取細(xì)胞沉淀，再加入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶靜置（37℃，30 min）。取細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，按1×104個(gè)/mL的密度接種至培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37℃，5%CO2，飽和濕度）。顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)再消化傳代。

1.2.3 肛提肌成肌細(xì)胞鑒定 磷酸鹽緩沖液（PBS）浸洗培養(yǎng)皿3次（3 min/次）。4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS浸洗培養(yǎng)皿 3次（3 min/次）。PBS配制的 Triton X-100（0.5%）室溫通透20 min。PBS浸洗培養(yǎng)皿3次（5 min/次），移液槍吸干PBS，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加牛血清白蛋白溶液（5%）封閉30 min（37℃）。移液槍吸干封閉液，不洗。在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加足夠量的稀釋好的一抗：兔抗橫紋肌輔肌動(dòng)蛋白抗體（1∶250），4℃孵育過(guò)夜。PBS浸洗培養(yǎng)皿3次（3 min/次），移液槍吸干多余液體，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加稀釋好的熒光二抗：FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶200），37℃孵育 30 min。PBS浸洗培養(yǎng)皿 3次（3 min/次）。在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加DAPI避光孵育5 min。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBS洗去多余的DAPI，20%甘油封閉培養(yǎng)皿。在熒光顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。

1.2.4 MTT法檢測(cè)肛提肌成肌細(xì)胞增殖活力 取SUI患者的第3代肛提肌成肌細(xì)胞，分為4組：SUI組（0 ng/mL）加1 μL生理鹽水，MGF組（50 ng/mL）加 1 μL濃度為 50 ng/mL的MGF，MGF組（100 ng/mL）加 1 μL濃度為 100 ng/mL 的 MGF，MGF組（150 ng/mL）加 1 μL濃度為 150 ng/mL的 MGF，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞密度重懸為1×104個(gè)/mL（血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)），加至96孔板（每孔100 μL）繼續(xù)培養(yǎng)。顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)70%～80%時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)液，孵育 24 h。分別于干預(yù)后 24 h、48 h、72 h，每孔加 50 μL MTT試劑，4 h后吸出上清，加150 μL二甲基亞砜，振蕩器振蕩10 min，在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（OD）值。計(jì)算公式：細(xì)胞存活率（%）=[OD（MGF組）-OD（空白）]/[OD（SUI組）-OD（空白）]×100%。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法檢測(cè)肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin mRNA的表達(dá) 于SUI患者的第3代肛提肌成肌細(xì)胞孵育72 h后，采用RT-PCR法測(cè)定SUI組（0 ng/mL）、MGF 組（150 ng/mL）Laminin、Dystrophin mRNA 的含量，取直腸癌根治術(shù)患者的第3代肛提肌成肌細(xì)胞作為對(duì)照組。根據(jù)說(shuō)明書(shū)用總RNA提取試劑盒、超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將Laminin上游引物設(shè)計(jì)為5′-CTCTGGGGAACTGGAGAATC-3′，下游引物設(shè)計(jì)為 5′-ACTTGGGCGTGAACTTGTAG-3′。Dystrophin上游引物設(shè)計(jì)為 5′-TTTGGTGGGAAGAAGTAGAGG-3′，下游引物設(shè)計(jì)為 5′-GTTGACATTGTTCAGGGCAT-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物設(shè)計(jì)為5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′，下游引物設(shè)計(jì)為 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3′。這三者產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為72 bp、230 bp和 224 bp。PCR 反應(yīng)體系 25 μL：95℃ 10 min預(yù)變性；95℃10 s變性；57℃30 s退火；72℃30 s延伸，循環(huán)40次。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt比較法算出各組肛提肌成肌細(xì)胞中Laminin、Dystrophin mRNA的相對(duì)表達(dá)量。在P＜0.05 的情況下，如果 2-ΔΔCt＜1，說(shuō)明目的基因在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)下調(diào)；如果 2-ΔΔCt＞1，說(shuō)明目的基因表達(dá)上調(diào)；否則表達(dá)無(wú)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；MGF 濃度、MGF 作用時(shí)間、肛提肌成肌細(xì)胞存活率的數(shù)據(jù)資料采用析因設(shè)計(jì)的方差分析；肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin mRNA表達(dá)的數(shù)據(jù)資料采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肛提肌成肌細(xì)胞電鏡觀(guān)察及鑒定 與對(duì)照組相比，SUI組（0 ng/mL）第3代肛提肌成肌細(xì)胞生長(zhǎng)密度較小，細(xì)胞形態(tài)較皺縮，光澤度較弱。MGF組（50 ng/mL）、MGF 組（100 ng/mL）、MGF 組（150 ng/mL）的細(xì)胞生長(zhǎng)密度漸增大，細(xì)胞形態(tài)漸飽滿(mǎn)，結(jié)構(gòu)漸完整，光澤度漸強(qiáng)。見(jiàn)圖1。對(duì)照組和SUI組（0 ng/mL）第3代肛提肌成肌細(xì)胞均表達(dá)骨骼肌細(xì)胞標(biāo)志性蛋白——橫紋肌肌動(dòng)蛋白。見(jiàn)圖2（見(jiàn)后插一）。

圖1 各組第3代肛提肌成肌細(xì)胞電鏡觀(guān)察

2.2 不同濃度、不同干預(yù)時(shí)間肛提肌成肌細(xì)胞存活率比較 不同濃度MGF促進(jìn)肛提肌成肌細(xì)胞增殖的效果不同（F濃度=65.055，P濃度=0.000）；不同 MGF作用時(shí)間促進(jìn)肛提肌成肌細(xì)胞增殖的效果不同（F時(shí)間=24.586，P時(shí)間=0.000）；MGF 濃度和 MGF 作用時(shí)間兩因素間存在交互作用（F時(shí)間×濃度=3.222，P時(shí)間×濃度=0.008），當(dāng)MGF濃度為150 ng/mL和MGF作用時(shí)間為72 h時(shí)，肛提肌成肌細(xì)胞存活率最高。見(jiàn)表1。

2.3 各組肛提肌成肌細(xì)胞 Laminin、Dystrophin mRNA的表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，SUI組（0ng/mL）肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin mRNA的表達(dá)量降低（P＜0.05）；與 SUI組（0 ng/mL）比較，MGF 組（150 ng/mL）肛提肌成肌細(xì)胞 Laminin、Dystrophin mRNA的表達(dá)量增加（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表1 不同濃度、不同干預(yù)時(shí)間肛提肌成肌細(xì)胞存活率比較（±s，%）

表1 不同濃度、不同干預(yù)時(shí)間肛提肌成肌細(xì)胞存活率比較（±s，%）

注：F 濃度=65.055，P 濃度=0.000；F 時(shí)間=24.586，P 時(shí)間=0.000；F 時(shí)間×濃度=3.222，P 時(shí)間×濃度=0.008。

MGF濃度 n 24 h 48 h 72 h SUI組（0 ng/mL） 6 100 100 100 MGF 組（50 ng/mL） 6 104.607±4.931 106.218±2.356 115.722±4.577 MGF 組（100 ng/mL） 6 108.316±4.282 110.669±3.184 115.946±4.791 MGF 組（150 ng/mL） 6 112.159±4.127 114.245±3.026 120.228±4.046

表2 各組肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin mRNA的表達(dá)量比較（±s，2-ΔΔCt值）

表2 各組肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin mRNA的表達(dá)量比較（±s，2-ΔΔCt值）

注：a與對(duì)照組比較，P＜0.05；b 與 SUI組比較，P＜0.05。

組別 n Laminin mRNA Dystrophin mRNA對(duì)照組 3 1.028±0.029 0.964±0.137 SUI組（0 ng/mL） 3 0.404±0.050a 0.505±0.177a MGF 組（150 ng/mL） 3 0.871±0.110b 0.846±0.173b F 32.789 5.134 P 0.000 0.029

3 討論

中國(guó)成年女性SUI、急迫性尿失禁和混合性尿失禁相應(yīng)的比例分布分別為61%、8%和31%，患病率分別為18.9%、2.6%和9.4%，在50～59歲年齡段，SUI的患病率最高，為28.0%[1]。SUI患者不僅表現(xiàn)為腹壓增加下不自主溢尿，還可出現(xiàn)性交不適、尿路感染、外陰濕疹等，同時(shí)伴隨羞恥、尷尬、自卑、抑郁等情緒，導(dǎo)致患者減少外出工作、生活及社交，并減少性行為。Lim等[2]招募年齡≥21歲、處于性活躍期的女性310例（SUI患者134例，無(wú)SUI健康受試者176例）及其伴侶進(jìn)入研究，女性完成Golombok Rust性滿(mǎn)意度量表（GRISS）和國(guó)際尿失禁咨詢(xún)委員會(huì)-下尿路癥狀-生活質(zhì)量問(wèn)卷（ICIQ-Lutsqol），伴侶僅完成GRISS量表，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與無(wú)SUI健康受試者相比，SUI患者總體性功能、性交頻率、滿(mǎn)意度均較低（P＜0.001），生活質(zhì)量也較差；與無(wú)SUI健康受試者的伴侶相比，SUI患者的伴侶在勃起功能障礙方面存在更多問(wèn)題。除此之外，SUI的經(jīng)濟(jì)成本也很高，大多數(shù)原因在于患者自付的可吸收墊、洗衣等尿失禁常規(guī)護(hù)理所需資源的費(fèi)用。且每人每年在SUI上的花費(fèi)差異很大，大約在50～1 000美元之間，SUI程度越嚴(yán)重，患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)越重[3]。

目前，非手術(shù)和手術(shù)方式均已用于女性SUI治療。非手術(shù)方式包括認(rèn)知行為療法、注射療法、物理治療、西藥治療和中醫(yī)治療等[4-6]。手術(shù)方式包括經(jīng)陰道無(wú)張力尿道中段懸吊術(shù)（TVT）、經(jīng)閉孔（由外向內(nèi)）無(wú)張力尿道中段懸吊術(shù)（TOT）、經(jīng)閉孔（由內(nèi)向外）無(wú)張力尿道中段懸吊術(shù)（TVT-O）、單切口尿道中段吊帶術(shù)和Cooper韌帶懸吊術(shù)等[7-10]。手術(shù)方式治療女性SUI有其適應(yīng)證，且患者需承擔(dān)手術(shù)治療所帶來(lái)的創(chuàng)傷、風(fēng)險(xiǎn)、費(fèi)用和并發(fā)癥等問(wèn)題[11-12]。近年來(lái)，非手術(shù)方式治療女性輕、中度SUI得到了臨床工作者的廣泛研究，它們或微創(chuàng)，或無(wú)創(chuàng)，在風(fēng)險(xiǎn)、費(fèi)用和并發(fā)癥等方面的問(wèn)題較少，同時(shí)又能幫助患者改善SUI癥狀。

迄今為止，已有多種理論和學(xué)說(shuō)用于解釋SUI的發(fā)病機(jī)制。在盆底整體理論和吊床理論這兩種理論中，均強(qiáng)調(diào)了尿控機(jī)制中肛提肌的重要作用[13]。與其他大多數(shù)骨骼肌不同，肛提肌除了排尿、排便和Valsalva動(dòng)作外，能一直保持休整狀態(tài)，具有在腹壓突然增加的情況下快速收縮的能力，從而最大限度地減少尿失禁和盆腔器官脫垂的風(fēng)險(xiǎn)，矛盾的是，肛提肌必須在分娩期間延伸甚至超出其限度，以允許嬰兒通過(guò)，但其在分娩后收縮以恢復(fù)正常功能[14]。SUI與肛提肌的損傷密切相關(guān)，而肛提肌作為骨骼肌，是有絲分裂后的組織，一旦形成，細(xì)胞分裂就不會(huì)發(fā)生在肌纖維內(nèi)，在產(chǎn)后誘導(dǎo)的肌肉生長(zhǎng)過(guò)程中，所需的增殖細(xì)胞（成肌細(xì)胞）來(lái)源于肛提肌干（衛(wèi)星）細(xì)胞池，代表肛提肌自我修復(fù)的生物學(xué)儲(chǔ)備[15]。

MGF是胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin like growth factor-1，IGF-1）可變剪接的產(chǎn)物，IGF-1 mRNA 前體3′端的選擇性剪接編碼3種不同的IGF-1前體蛋白：IGF-1Ea、IGF-1Eb 和 IGF-1Ec（信號(hào)肽+IGF-1成熟肽+E結(jié)構(gòu)域），這3種蛋白質(zhì)都含有成熟的IGF-1肽，并在E結(jié)構(gòu)域的氨基端部分共享一個(gè)共同的16個(gè)氨基酸序列，由于E結(jié)構(gòu)域羧基端的氨基酸序列不同，導(dǎo)致IGF-1這3種剪接變體具有不同的作用[16-19]。機(jī)械信號(hào)作用于嚙齒類(lèi)動(dòng)物和人類(lèi)體內(nèi)除了肝臟以外的其他組織，以自分泌或旁分泌的形式產(chǎn)生嚙齒類(lèi)動(dòng)物的IGF-1Eb和人類(lèi)的IGF-1Ec，命名為MGF。大量研究報(bào)道，早在肌肉損傷后2～24 h，MGF表達(dá)就會(huì)上調(diào)，通過(guò)其高度帶正電荷的E結(jié)構(gòu)域，迅速激活肌衛(wèi)星細(xì)胞，促進(jìn)有絲分裂從而促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，發(fā)揮骨骼肌損傷后修復(fù)作用[20-22]。吳國(guó)梁等[23]以SD大鼠的腓腸肌為研究對(duì)象，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MGF的促增殖作用。黃艷等[24]對(duì)產(chǎn)后SUI模型大鼠施以MGFE肽注射治療，發(fā)現(xiàn)治療后SD大鼠的最大膀胱容量和漏尿點(diǎn)壓力均提高，尿道括約肌和肛提肌組織的肌纖維再生也較治療前更豐富。王聰娜等[25]發(fā)現(xiàn)外源性MGF E肽可促進(jìn)產(chǎn)后SUI模型大鼠內(nèi)源性MGF的表達(dá)。

Laminin是由α、β和γ亞基的特定組合組成的異源三聚體蛋白，其α2鏈在骨骼肌的細(xì)胞外基質(zhì)中高表達(dá)，Dystrophin-糖蛋白復(fù)合物由幾種跨膜和外周成分組成，在骨骼肌的肌纖維膜中高表達(dá)，Dystroglycan是Dystrophin-糖蛋白復(fù)合物的核心蛋白，外周膜蛋白α-Dystroglycan以高親和力結(jié)合Laminin α2鏈，同時(shí)與跨膜蛋白β-Dystroglycan相連，后者又與結(jié)合了細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的Dystrophin相連，形成細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白之間的機(jī)械連接[26-28]。機(jī)械刺激作用于骨骼肌，破壞細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞骨架連鎖，使肌纖維膜穩(wěn)定性喪失、Laminin依賴(lài)性信號(hào)傳導(dǎo)破壞、對(duì)肌肉收縮期間肋狀體（costameres）側(cè)向傳遞力耐受程度降低等，可能導(dǎo)致各種肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的發(fā)生[27-29]。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度MGF促進(jìn)肛提肌成肌細(xì)胞增殖的效果不同（P＜0.05）；不同MGF作用時(shí)間促進(jìn)肛提肌成肌細(xì)胞增殖的效果不同（P＜0.05）；MGF濃度和MGF作用時(shí)間兩因素間存在交互作用（P＜0.05），當(dāng) MGF濃度為 150 ng/mL、作用時(shí)間為72 h時(shí)肛提肌成肌細(xì)胞存活率最高。說(shuō)明MGF濃度和MGF作用時(shí)間兩因素可交互作用，促進(jìn)體外培養(yǎng)的SUI患者的肛提肌成肌細(xì)胞增殖，證實(shí)了MGF的促增殖作用，與上述結(jié)論一致。不同于本研究，孫婧瑜等[30]以SD大鼠的腓腸肌衛(wèi)星細(xì)胞為研究對(duì)象，證實(shí)了MGF的促增殖作用。吳國(guó)梁等[23]則對(duì)健康成年SD大鼠的腓腸肌進(jìn)行被動(dòng)拉伸訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)不管拉伸方式是持續(xù)性還是重復(fù)性，拉伸訓(xùn)練后SD大鼠腓腸肌MGF及其mRNA的表達(dá)水平均顯著上升，同時(shí)腓腸肌濕重明顯增加。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，SUI組（0 ng/mL）與對(duì)照組比較，肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin的表達(dá)降低（P＜0.05）。與SUI組（0 ng/mL）比較，MGF組（150 ng/mL）肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin的表達(dá)增加（P＜0.05）。提示MGF可促進(jìn)SUI患者肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin的表達(dá)。Dystrophin表達(dá)降低與SUI發(fā)生的關(guān)系在王莉娜等[31]的研究中亦得到證實(shí)。Ca??o-Benedini等[27]在右后肢固定（保持足背完全跖屈）10 d大鼠的比目魚(yú)肌中發(fā)現(xiàn)了Laminin和Dystrophin表達(dá)增加。MGF促進(jìn)Laminin、Dystrophin表達(dá)的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，MGF可通過(guò)促進(jìn)肛提肌成肌細(xì)胞的增殖以及Laminin、Dystrophin的表達(dá)來(lái)修復(fù)SUI患者損傷的肛提肌。生長(zhǎng)因子注射療法很有前景，未來(lái)的研究必須確定其使用的適應(yīng)證、有吸引力的生長(zhǎng)因子、最佳的手術(shù)技術(shù)和方法、最佳的實(shí)施注射時(shí)間、生長(zhǎng)因子的劑量以及開(kāi)發(fā)臨床相關(guān)的動(dòng)物模型，深入理解生長(zhǎng)因子療法改善SUI的機(jī)制。