魯海珍，尹英愛，呂寧

100021 北京，國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院 病理科(魯海珍、呂寧)；102401 北京，首都醫(yī)科大學良鄉(xiāng)教學醫(yī)院 病理科(尹英愛)

喉癌的主要治療方法是手術和放療，初治后復發(fā)并不少見，給患者帶來后續(xù)治療的痛苦，影響患者的生存質量和生存期，也給臨床治療帶來挑戰(zhàn)。如何篩選與復發(fā)相關的危險因素，是頭頸領域研究者奮斗的方向之一[1]。喉癌的組織學類型絕大部分是鱗狀細胞癌(文中簡稱喉癌)，癌前病變?yōu)轺[狀上皮中-重度不典型增生、原位癌。影響喉癌術后復發(fā)的因素復雜多樣[2]。為探討喉癌復發(fā)的相關因素，我們回顧性分析95例喉癌及癌前病變患者的病例資料，分析腫瘤分子標志物(包括p53、c-Myc、PTEN、survivin、p21和p27)表達情況及臨床病理因素與喉癌復發(fā)的相關性。

1 材料與方法

1.1 標本來源

通過中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院病案室編目組、病理科數字檔案管理系統(tǒng)進行統(tǒng)計，自1999年1月至2015年12月喉癌、聲帶鱗狀上皮不典型增生、原位癌共608例，期間58例患者術后3年內復發(fā)，復發(fā)率9.5%(58/608)。入排標準為：喉癌及癌前病變根治性R0切除術后3年內復發(fā)的病例入組，優(yōu)選早期病例；初次手術切緣陽性術后復發(fā)或腫瘤組織過小無法進行免疫組化檢測的病例排除。經篩選，最終入復發(fā)組41例。作為對照，將未復發(fā)的早期喉癌或不典型增生、原位癌病例54例入組對照組，共95例。所有標本均經10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，4μm涂膠白片以備免疫組化檢測。

1.2 免疫組化方法

腫瘤涂膠白片75℃烤箱30分鐘，脫蠟至水。用PTLINK設備進行抗原修復，97℃烤箱23分鐘，阻斷液室溫封閉10分鐘，PBS沖洗3分鐘；一抗孵育：滴加一抗(p21、p27、survivin、c-Myc、p53和PTEN)工作液，室溫孵育40 分鐘；PBS沖洗3分鐘。二抗室溫孵育20 分鐘，PBS沖洗3分鐘； DAB顯色，清水沖洗終止顯色，蘇木素復染，1%鹽酸乙醇分化，氨水返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。修復液、阻斷液及二抗等試劑均采用DAKO公司Envision 產品。根據腫瘤細胞著色強度和比例相乘結果對免疫組化結果評分進行分組，具體如下：著色腫瘤細胞比例按<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%和≥75%分為0～4分，著色強度按未著色、淡黃、淺棕和深棕分為0、1、2、3。以二者相乘分數(0～12)，分為4組，陰性組≤1分，弱陽性組2～3分，中陽性組4～7分，強陽性組≥8。若按陰性和弱陽為一組，而中陽和強陽為一組，分為兩組表達，進一步分析。一抗信息詳見表1。

表1 免疫組化抗體列表

Table 1. Immunohistochemistry Antibodies

First antibody (Clone)First antibody incubation timeIncorporatedCategory numberPositive locationp21 (DCS-60.2)40 minsZSGB-BIOZM-0206Nuclearp27 (EP104)40 minsZSGB-BIOZA-0557NuclearSurvivin (EP119)40 minsZSGB-BIOZA-0530Nuclearc-Myc (Y69)40 minsMXBRMA-0664Nuclearp53 (DO-7)40 minsMXBKIT-0010NuclearPTEN (6H2.1)40 minsDAKOM3627Cytoplasm

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學數據處理，計數資料使用卡方檢驗或Fisher 精確檢驗，以P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 臨床病理基本信息

復發(fā)組全部為男性，平均年齡(65±10.9)歲；聲門上型5例，聲門型36例；病理顯示不典型增生2例，原位癌3例，高、中、低分化者分別為8、22、6例；腫瘤病理T分期：pTis 3例，pT1 22例，pT2 11例，pT3 3例；腫瘤病理N分期：pN0 15例，pN1 7例，pN2 5例，未行淋巴結清掃14例；吸煙者36例，酗酒者24例，不飲酒或偶飲酒17例。未復發(fā)組男51例，女3例，平均年齡(65±8.5)歲；病理顯示原位癌24例，高、中、低分化為12、15、3例；腫瘤病理T分期：pTis 24例，pT1 29例，pT2 0例，pT3 1例；腫瘤病理N分期：pN0 53例，pN1 1例；吸煙者50例，酗酒者27例，不飲酒或偶飲酒27例 (詳見表2)。

表2 95例入組患者臨床病理信息

Table 2. Correlation between Clinical Pathology and Tumor Recurrence in 95 Cases of Laryngeal Carcinoma

VariableRecurrence group (%)Nonrecurrence group (%)Correlation, P?AgeAverage (y)6565>0.05Median(y)6464GenderMale41(100)51(94.4)0.179Female03(5.6)SmokeYes36(87.8)50(92.6)>0.05No5(12.2)4(7.4)Drink alcoholYes24(58.5)27(50.0)>0.05No or a little17(41.5)27(50.0)DifferentiationSquamous CAWell8(19.5)12(22.2)<0.001Intermidiate22(53.7)15(27.8)Poor6(14.6)3(5.6)Cacinoma in situ3(7.3)24(44.4)Atypical hyperplasia2(4.9)0pTTis3(7.3)24(44.4)Non-random selection, not applicableT122(53.7)29(53.7)T211(26.8)0T33(7.3)1(1.9)Atypical hyperplasia2(4.9)0pNN015(36.6)53(98.1)Non-random selection, not applicableN17(17.1)1(1.9)N25(12.2)0NX14(34.1)0SiteSupraglottis5(12.2)42(77.8)0.161Glottis36(87.8)12(22.2)

*Fisher exact test.

2.2 臨床病理與腫瘤復發(fā)的關系

腫瘤復發(fā)與腫瘤分化相關，分化差的喉癌復發(fā)率更高，結果具有統(tǒng)計學意義(P<0.001，F(xiàn)isher精確檢驗，表2)，具體為中-低分化喉癌復發(fā)病例28例(60.8%)，未復發(fā)18例；高分化喉癌復發(fā)病例8例(40.0%)，未復發(fā)12例；原位癌復發(fā)3例(11.1%)，未復發(fā)24例。因入組病例為非隨機篩選，未復發(fā)組主要選擇的是原位癌和早期喉癌，故對于腫瘤病理分期與腫瘤復發(fā)相關性無法判斷(表2)。對本組病例中的pT1期病理進行復發(fā)與未復發(fā)組對比，未發(fā)現(xiàn)鱗狀細胞癌的分化與腫瘤復發(fā)有關，因此這一結果還有待進一步驗證(表3)。無論是95例病例的比較還是51例pT1期的復發(fā)與未復發(fā)兩組的比較，均未發(fā)現(xiàn)腫瘤復發(fā)與患者性別、年齡、是否吸煙、酗酒及部位相關(P>0.05， Fisher精確檢驗)。

2.3. 免疫組化檢測結果

2.3.1 腫瘤復發(fā)與c-Myc表達(圖1A)的相關性 依據方法中的免疫組化評分，按陰性、弱到強陽性表達分為4組(有1例患者的切片中未觀察到腫瘤)，腫瘤的復發(fā)與c-Myc蛋白表達強弱相關，復發(fā)組病例中36例(87.8%)呈強表達，而未復發(fā)組的強表達比率是64.2%，腫瘤復發(fā)與c-Myc表達顯著相關(P=0.016，F(xiàn)isher精確檢驗，表4)。本組pT1的病例中復發(fā)與未復發(fā)腫瘤c-Myc的表達具有同樣結果(P=0.047，F(xiàn)isher精確檢驗，表6)。

表3 T1期喉癌的臨床病理信息

Table 3. Correlation between Clinical Pathology and Tumor Recurrence in T1 Laryngeal Carcinoma Patients

VariableRecurrence group (%)Nonrecurrence group (%)Correlation, PAge≥6511(50)12(41.4%)0.371<6511(50)17(58.6%)GenderMale22(100)29(100%)Not calculatedFemale00SmokeYes18(81.8)28(96.6)0.669?No4(18.2)1(3.4)Drink alcoholYes13(59.1)15(51.7)0.406No or a little9(40.9)14(48.3)DifferentiationSquamous CAWell6(27.3)12(41.4)0.561?Intermidiate14(63.6)15(51.7)Poor2(9.1)2(6.9)pNN011(50)28(96.6)<0.001?N13(13.6)1(3.4)N23(13.6)0NX5(22.7)0SiteSupraglottis4(18.2)10(34.5)0.165Glottis18(81.8)19(65.5)

*Fisher exact test.

圖1 喉癌及癌前病變免疫組化表達×100

Figure1.ImmunohistochemicalExpressionofMarkersinLaryngealCarcinomaandPrecancerousLesions(×100)

A. c-Myc, located on nuclear, tumor cells are strong positive; B. Survivin, located on nuclear, tumor cells are median positive; C. PTEN, located on cytoplasm, precancerous lesion cells are weak positive; D. p21, located on nuclear, tumor cells are strong positive; E. p27, located on nuclear, tumor cells are strong positive; F. p53, located on nuclear, tumor cells are strong positive.

2.3.2 腫瘤復發(fā)與survivin表達(圖1B)的相關性 將免疫組化結果判讀分為兩組，一組為陰性和弱陽，另一組為中陽和強陽，分為兩組表達，進行分析，在95例患者復發(fā)與未復發(fā)比較中，發(fā)現(xiàn)survivin中-強表達的比率在復發(fā)組(24.4%)要低于無復發(fā)組(44.4%)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.035，F(xiàn)isher精確檢驗，表5)。在pT1期亦有同樣的結果趨勢，即在復發(fā)組無強陽性表達病例，而未復發(fā)組20.7%的腫瘤具有強表達(P=0.003，F(xiàn)isher精確檢驗，表6)。

2.3.3 腫瘤復發(fā)與PTEN表達(圖1C)的相關性 按兩組表達結果進行分析，PTEN在復發(fā)組僅有1例為中+強表達(2.4%)，而在未復發(fā)組中16.7%為中+強表達，二者間具有統(tǒng)計學差異(P=0.024，F(xiàn)isher精確檢驗，表5)。

2.3.4 腫瘤復發(fā)與p21、p27及p53表達(圖1D～F)的相關性 喉癌術后復發(fā)組與未復發(fā)組腫瘤組織中的p21、p27及p53(有1例患者的切片中未檢測到腫瘤)表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表4～6)。

表4 免疫組化結果四級分組結果與腫瘤復發(fā)相關性分析

Table 4. Correlation between Immunohistochemical Results (4 Groups) and Tumor Recurrence in 95 Cases of Laryngeal Carcinoma

MarkersScores (4 groups)Recurrence (%)Nonrecurrence (%)Correlation, P p21011(26.8)13(24.1)0.221111(26.8)8(14.8)216(39.0)22(40.7)33(7.4)11(20.4)Total41(100)54(100)c-Myc02(4.9)2(3.8)0.016?12(4.9)4(7.5)21(2.4)13(24.5)336(87.8)34(64.2)Total41(100)53(100)p53018(43.9)21(39.6)0.359?15(12.2)2(3.8)24(9.8)5(9.4)314(34.1)25(47.2)Total41(100)53(100)p2707(17.1)11(20.4)0.902112(29.3)13(24.1)211(26.8)17(31.5)311(26.8)13(24.1)Total41(100)54(100)PTEN035(85.4)38(70.4)0.058?15(12.2)7(13.0)208(14.8)31(2.4)1(1.9)Total41(100)54(100)Survivin012(29.3)6(11.1)0.072?119(46.3)24(44.4)28(19.5)17(13.0)32(4.9)7(13)Total41(100)54(100)

*Fisher exact test.

表5 免疫組化結果兩級分組結果與腫瘤復發(fā)相關性分析

Table 5. Correlation between Immunohistochemical Results (2 Groups) and Tumor Recurrence in 95 Cases of Laryngeal Carcinoma

MarkersScores (2 groups)Recurrence (%)Nonrecurrence (%)Correlation, Pp210+122(53.7)21(38.9)0.1102+319(46.3)33(61.1)Total41(100)54(100)c-Myc0+14(9.8)6(11.3)0.542?2+337(90.2)47(88.7)Total41(100)53(100)p530+123(56.1)23(43.4)0.1552+318(43.9)30(56.6)Total41(100)53(100)p270+119(46.3)24(44.4)0.5092+322(53.7)30(55.6)Total41(100)54(100)PTEN0+140(97.6)45(83.3)0.024?2+31(2.4)9(16.7)Total41(100)54(100)Survivin0+131(75.6)30(55.6)0.0352+310(24.4)24(44.4)Total41(100)54(100)

*Fisher exact test.

表6 T1期喉癌的免疫組化結果與腫瘤復發(fā)相關性分析

Table 6. Correlation between Immunohistochemical Results and Tumor Recurrence in T1 Laryngeal Carcinoma Patients

MarkersScores (4 groups)Recurrence (%)Nonrecurrence (%)Correlation, P?p2107(31.8)7(24.1)0.65315(22.7)5(17.2)29(40.9)13(44.8)31(4.5)4(13.8)c-Myc02(9.1)2(6.9)0.04711(4.5)1(3.4)208(27.6)319(86.4)17(58.6)p53010(45.5)11(37.9)0.71012(9.1)1(3.4)22(9.1)2(6.9)38(36.4)15(51.7)Survivin06(27.3)00.003110(45.5)15(51.7)26(27.3)8(27.6)306(20.7)p2705(22.7)6(20.7)0.77217(31.8)9(31.0)25(22.7)10(34.5)35(22.7)4(13.8)pTEN017(77.3)26(89.7)0.06314(18.2)1(3.4)202(6.9)31(4.5)0

*Fisher exact test.

3 討 論

喉癌或癌前病變術后或根治性放療后復發(fā)并不少見，來自國家癌癥中心和廣東省人民醫(yī)院的統(tǒng)計結果顯示，喉鱗狀細胞癌術后的復發(fā)率分別為20.2%[1]和23.4%[2]。而本組數據復發(fā)率約為9.5%，低于文獻報道，這可能與入組病例為3年內復發(fā)病例和R0切除，以及與多學科診治的開展、手術設備和技術的提升等有關。喉癌術后復發(fā)患者的疾病進展快、治療效果欠佳，解決這一問題的關鍵環(huán)節(jié)是如何對術后復發(fā)提早預警。從臨床角度分析，多篇文獻顯示手術切緣陽性、分化程度、臨床分期及吸煙或飲酒的狀態(tài)等與喉癌術后復發(fā)相關，與年齡、性別無顯著相關[1-2]。本組復發(fā)患者均為男性，可能與喉癌有明顯的男性傾向，并且男性中吸煙者和飲酒者的比例更高有關。本組結果亦提示，R0切除后腫瘤復發(fā)與腫瘤組織學分化程度存在相關性。

腫瘤分化程度與復發(fā)相關，分化越差，腫瘤復發(fā)率越高，這一結果在文獻中亦有相同報道[1-3]。腫瘤分化差與預后不良有關，與高分化的患者相比，低分化者的3年存活率明顯降低(45.1%vs88.5%)[4]。與喉癌預后相關的臨床病理因素還包括浸潤前沿腫瘤生長方式、血管神經侵犯、淋巴結轉移、癌侵犯被膜外等[5]。

有研究發(fā)現(xiàn)，喉癌手術切緣組織中survivin陽性者的局部復發(fā)率明顯高于陰性者(75.0%vs22.7%,P<0.05)[6]；本研究顯示腫瘤組織survivin的強表達者復發(fā)率反而低。雖觀察部位不同，但均顯示survivin的表達與腫瘤的復發(fā)相關，提示該基因改變對腫瘤復發(fā)判斷可能具有一定意義。有文獻報道，survivin蛋白的高表達還與淋巴結轉移、復發(fā)情況等臨床病理特征有相關性，與預后呈負相關[7]。上述結果與survivin的作用機制相關。Survivin作為凋亡抑制因子對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起一定作用，其主要通過抑制凋亡終末效應器caspase-3和caspase-7的活性或與周期蛋白激酶CDK4相互作用而阻斷凋亡信號轉導通路[8]。

c-Myc是一種包含亮氨酸拉鏈的轉錄因子，可以參與細胞轉化、細胞增殖、細胞凋亡和細胞周期調控[9]。本研究顯示c-Myc的表達越強，腫瘤復發(fā)率越高。國內亦有無顯著差異的研究報道[10]。c-Myc與腫瘤復發(fā)的相關性仍存爭議。然而，對c-Myc的結構和功能的研究及靶點治療為喉癌治療提供了新希望[11-12]。

PTEN作為抑癌基因，在腫瘤細胞浸潤、血管發(fā)生及腫瘤轉移中起一定抑制作用[13]。我們的結果顯示，喉癌腫瘤復發(fā)組與未復發(fā)組組織中PTEN的強表達情況存在差異(2.4%vs16.7%)，提示PTEN的強表達對腫瘤復發(fā)具有一定抑制作用(P=0.024)。另有研究對喉癌切緣組織行PTEN的檢測，顯示PTEN陽性者局部復發(fā)率明顯低于陰性者(37.1%vs100.0%,P<0.05)[6]。PTEN在腫瘤組織和切緣組織的表達降低均顯示與復發(fā)相關，提示可作為預測喉癌復發(fā)的分子指標。

野生型p53是重要的抑癌基因之一，突變型p53基因則發(fā)揮著原癌基因的作用，可促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]，其蛋白半衰期長，可通過免疫組織化學方法檢出[15]。在多數腫瘤中，可發(fā)現(xiàn)突變型p53蛋白的表達[16]。有研究顯示喉癌手術切緣中p53蛋白陽性與術后局部復發(fā)明顯相關[10]。p21與p27蛋白是細胞周期抑制蛋白，在細胞周期的調控中起重要作用[17-18]。p21基因存在p53依賴性和非依賴性兩種途徑，其表達與腫瘤預后關系的臨床研究報道也不盡相同[19]，與喉癌復發(fā)相關性的報道也有爭議[20-21]。p27蛋白表達在惡性腫瘤中的表達明顯低于良性病變，其表達減少或缺失與患者的不良預后可能有一定關系[18,22]。而Korkmaz等[21]的研究結果顯示，P27的高表達與早期喉癌復發(fā)有關。本研究中，上述蛋白的表達與喉癌或癌前病變術后復發(fā)無明顯相關性(P>0.05)，說明上述基因蛋白表達在該領域還有待進一步研究，目前尚不能作為喉癌復發(fā)預警的標志物。

綜上所述，影響喉癌或癌前病變術后復發(fā)是多因素的，本研究綜合臨床病理因素及熱點腫瘤標志物的分析，提示c-Myc、survivin及PTEN的表達與腫瘤復發(fā)存在一定相關性，為患者的預后預警提供一定的幫助。

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