楊旭穎 安麗君

摘要：表皮毛是由高等植物地上部組織表皮細胞發(fā)育而來的一種特殊結構，細胞周期調控因子在植物表皮毛細胞形態(tài)的建成過程中發(fā)揮著重要作用。利用原核表達系統(tǒng)，構建pET-28a-KRP2-FLAG融合表達載體，在大腸桿菌中對擬南芥細胞周期依賴激酶抑制因子KRP2進行了體外表達，并利用蛋白標簽FLAG和His對目的蛋白進行純化。結果表明，在大腸桿菌系統(tǒng)中成功對KRP2-FLAG進行了體外表達并得到了純化的蛋白，蛋白量為0.87 mg。這為進一步研究KRP2在表皮毛細胞發(fā)育過程中的作用奠定了基礎。

關鍵詞：表皮毛;細胞周期調控因子;KRP2;原核表達;FLAG標簽;His標簽;蛋白純化;擬南芥;基因克隆;重組蛋白

中圖分類號： Q78;S188+.2? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0063-03

植物表皮毛是植物地上組織表皮細胞形成的一種特化結構，與表皮鋪板細胞持續(xù)進行有絲分裂不同，表皮毛細胞在命運決定之后將退出有絲分裂周期轉而進入核內(nèi)復制。在模式植物擬南芥中，成熟的葉片表皮毛細胞需要經(jīng)歷4次核內(nèi)復制，從而使其核內(nèi)DNA含量達到32C，進而形成特定的形態(tài)[1]。細胞周期調控因子在細胞由有絲分裂向核內(nèi)復制轉換的過程中發(fā)揮著關鍵的調節(jié)作用，其中細胞周期素依賴性激酶（CDK）是植物細胞周期的中心調控因子，細胞周期的一些進程是通過調節(jié)CDKs活性進行的[2]。與細胞周期素相對的是CDK抑制因子，它通過與CDKs直接結合負調控CDKs活性[3]。植物中第1種CDK抑制因子是由7種基因共同編碼的kip相關蛋白家族（KRP）：ICK1/KRP1、ICK2/KRP2、KRP3、KRP4、KRP5、KRP6、KRP7。ICK1/KRP1、ICK2/KRP2、KRP6過表達強烈抑制生長并且影響器官形態(tài)建成。KRPs是一類帶有C末端區(qū)域（CTD）的小蛋白，它是結合CDK或細胞周期蛋白并執(zhí)行KRPs抑制功能所必需的一類因子[4]。而CDK活性在G1/M期和G2/M期轉換時會升高并且與蛋白磷酸化、起始DNA復制、有絲分裂相關;轉錄水平調控、蛋白互作、轉錄后修飾或蛋白降解都能改變CDK活性，最終調控細胞周期進程[5]。酵母雙雜體系中除了KRP5，其他KRPs都與CDKA;1（A類CDK激酶）互作而不與CDKB1;1互作，并且所有的KRPs可以與D型細胞周期素互作，表明KRPs抑制CYCD-CDKA復合物活性[6]。

CDKA;1和其特異性抑制因子KRP2調控擬南芥葉片發(fā)育過程中有絲分裂向核內(nèi)復制的轉換。在有絲分裂活性組織中，調節(jié)KRP2過表達可降低CDKA;1活性，而在核內(nèi)復制的組織中它的活性不會降低，反而促進核內(nèi)復制。CDKA;1的弱表達導致了CDK有絲分裂活性的特異性抑制，從而誘導核內(nèi)周期。CDKB1;1通過使KRP2磷酸化調控蛋白酶體降解;CDKB1;1的mRNA和蛋白水平在有絲分裂組織中要高于核內(nèi)復制組織，表明CDKB1;1促進KRP2降解并且通過維持CDKA;1活性來抑制有絲分裂進入核內(nèi)周期[7]。KRP2蛋白可以通過CDK磷酸化和蛋白酶體降解機制調節(jié)轉錄后翻譯[8]，不同CDK蛋白之間的互作可以控制不同時期特異的CDK活性。

為進一步研究KRP2在高等植物細胞周期中的生物學功能，本研究對擬南芥KRP2基因CDS序列進行克隆，并在其3′端添加編碼FLAG標簽的核苷酸序列，構建了pET-28a-KRP2-FLAG融合表達載體;通過在大腸桿菌BL21（DE3）中體外表達，利用鎳柱親和層析純化，成功獲得了His-KRP2-FLAG重組蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料、菌株和載體 擬南芥Columbia（Col-0）生態(tài)型野生型種子、大腸桿菌TOP10和BL21（DE3）、原核表達載體pET-28a，均由西北農(nóng)林科技大學生命科學學院分子遺傳實驗室保存。

1.1.2 試劑 試驗中用到的限制性內(nèi)切酶、高保真DNA聚合酶Prime Star、T4連接酶、牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）、反轉錄酶等購自Takara公司;His標簽蛋白純化柱填料Ni Sepharose 6 Fast Flow、硝酸纖維素膜（0.45 μm），購自通用電氣醫(yī)療集團生命科學部;6xHis抗體購自Abcam公司，F(xiàn)LAG抗體購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥KRP2基因片段克隆 提取野生型擬南芥總RNA，反轉錄獲得cDNA;以此為模板用帶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點的引物進行PCR擴增;引物序列F：5′-CATGGATCCATGGCGGCGGTTAGGAGAAG-3′;R：5′-CATCTCGAGTCACTTATCATCATCATCTTTATAATCTGGATTCAATTTAACCC-3′（下劃線分別表示BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點），引物由北京六合華大基因有限生物公司合成。用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切擴增片段和pET-28a載體，連接酶切產(chǎn)物并轉化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，對陽性重組質粒pET-28a-KRP2-FLAG進行測序鑒定[9]。

1.2.2 重組蛋白的誘導表達 將測序正確的重組質粒轉化至大腸桿菌BL21（DE3）表達菌株中，過夜培養(yǎng)后挑取陽性單克隆接種到50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min小規(guī)模培養(yǎng)，待菌液D600 nm達到0.5～1.0時，加入終濃度為 0.2 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于 37 ℃ 誘導表達。分別收集誘導前和誘導后菌液，4 000 g離心10 min，收集菌體并用裂解緩沖液Lysis Buffer[50 mmol/L NaH2PO4（pH值8.0），300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑]重懸，冰浴，進行超聲破碎（25 W，工作5 s，間歇5 s，15 min），結束后4 ℃、1 000 g離心30 min，分別收集上清和沉淀。以誘導前菌液為對照，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳檢測重組蛋白的表達情況，之后利用BIO-RAD凝膠成像軟件分析誘導出的蛋白量，以不同梯度（0.125，0.250，0.500，1.000 mg/mL） 牛血清白蛋白BSA質量濃度為標準對照[10-11]。

由于重組蛋白N端帶有His，C端帶有FLAG標簽，所以本試驗同時用Anti-His和Anti-FLAG進行免疫印跡檢測。將2份蛋白樣品通過電轉儀轉移到硝酸纖維素膜上，室溫條件下用含50 g/L脫脂奶粉的TBST[20 mmol/L Tris-HCl（pH值7.5），體積分數(shù)0.1%的Tween 20，150 mmol/L NaCl]封閉 1 h，然后分別加入經(jīng)封閉液稀釋的Anti-His（1 ∶ 10 000，體積比）和Anti-FLAG（1 ∶ 1 000，體積比）4 ℃過夜孵育，次日將2塊膜用1×TBST洗3次，然后均加入鼠抗G&M（1 ∶ 10 000 體積比）室溫孵育 1 h，1×TBST洗3次，再用TBS洗膜 5 min，加入ECL工作液進行顯色。

1.2.3 重組蛋白的純化 重組蛋白小規(guī)模原核表達成功后，按照原條件進行目標蛋白擴大培養(yǎng)，收集400 mL IPTG誘導后的菌液，4 ℃、10 000 g離心10 min，菌體用Lysis Buffer重懸，因為后續(xù)試驗需要有活性的蛋白，故超聲破碎后離心收集上清，并將上清用0.22 μm濾膜超濾，然后和600 μL鎳柱混合，室溫孵育1 h，轉入簡易重力柱裝置中，分別用0、50、100、200、400 mmol/L濃度的咪唑洗脫蛋白并檢測[12-13]。

2 結果與分析

2.1 擬南芥KRP2目的基因片段克隆

由擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（www.arabidopsis.org）公布的基因序列可知，KRP2基因的CDS長度為666 bp。以野生型擬南芥cDNA為模板，用帶有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點的引物擴增得到了與預期大小吻合的片段（圖1）;用BamHⅠ和XhoⅠ酶切目的片段與pET-28a載體（圖2），目的基因的條帶約為650 bp，載體骨架的大小約為5.3 ku。

2.2 原核表達載體pET-28a-KRP2的鑒定

目的基因片段與載體連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌后選取陽性克隆并提取質粒DNA進行雙酶切，經(jīng)電泳檢測表明目的基因片段成功克隆到了pET-28a表達載體中（圖3）。為了驗證克隆到載體中的目的基因片段序列是否正確，將 pET-28a-KRP2重組質粒進行了測序，結果表明克隆到的序列與數(shù)據(jù)庫公布的序列完全一致，pET-28a-KRP2重組質粒構建成功，基因結構如圖4所示。

2.3 重組蛋白的誘導表達

將構建好的pET-28a-KRP2重組質粒轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，建立重組蛋白的原核表達系統(tǒng)。37 ℃、0.2 mmol/L IPTG誘導表達。取誘導前，誘導后及超聲波處理后的上清和沉淀檢測誘導表達情況。結果顯示，誘導后的菌液相比于誘導前在25～37 ku出現(xiàn)了新的蛋白條帶（圖5），與預測的KRP2蛋白分子量一致。為了進一步確認誘導表達出的蛋白條帶是目的KRP2-FLAG重組蛋白，分別以His和FLAG蛋白標簽的抗體對誘導出的蛋白進行免疫印跡檢測，結果表明誘導出的新蛋白條帶能被His標簽抗體和FLAG標簽抗體識別，證明本試驗利用原核表達系統(tǒng)成功誘導出KRP2-FLAG蛋白，且重組蛋白主要存在于沉淀，上清中量較少，表明得到的重組蛋白主要以包涵體形式存在。通過Image Lab軟件灰度分析對目的蛋白濃度進行定量，得到誘導后重組蛋白濃度約為0.181 mg/mL。

2.4 KRP2-FLAG重組蛋白的純化

試驗后續(xù)是研究KRP2與CDKA;1、CDKB1;1三者之間的互作效應， 需要具有活性的KRP2蛋白，而沉淀中的KRP2蛋白以不溶性包涵體形式存在，幾乎沒有活性，因而考慮通過擴大培養(yǎng)菌體，利用鎳柱親和層析純化上清中的活性重組蛋白。將誘導后的菌液經(jīng)超聲波破碎后離心收集上清，與鎳柱室溫孵育后，用不同濃度咪唑洗脫并收集KRP2-FLAG蛋白，SDS-PAGE與免疫印跡檢測洗脫液。本試驗成功獲得了純度較高的重組蛋白，且利用BSA標準蛋白定量，最終共得到0.87 mg重組蛋白（圖6）。

3 討論與結論

植物中細胞分化調控已經(jīng)取得了相當不錯的進展，然而對高度可信的植物發(fā)育調控還沒有一個較好的解釋。目前研究證明了一些通過轉錄因子直接控制細胞周期的相關基因，發(fā)現(xiàn)與細胞周期調控有關的因子主要包括三大類：細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，這3類因子相互作用，共同調控細胞周期[14]。KRP2作為CDK抑制因子之一，在G1/S轉換期，被泛素酶體降解掉，CDK被激活，進入S期。有絲分裂周期向核內(nèi)周期的轉換機制對揭示細胞分化和器官大小控制進程具有重要作用，為進一步研究KRP2在高等植物中如何控制細胞進程，本研究通過克隆擬南芥KRP2基因，以及原核表達并純化出具有活性的重組KRP2-FLAG蛋白，以期為后續(xù)研究有絲分裂向核內(nèi)周期轉換時CDKA;1、KRP2和CDKB1;1三者之間更為精確的互作效應奠定基礎。

參考文獻：

[1]高 英，郭建強，趙金鳳. 擬南芥表皮毛發(fā)育的分子機制[J]. 植物學報，2011，46（1）：119-127.

[2]Menges M，Hennig L，Gruissem W，et al. Cell cycle-regulated gene expression in Arabidopsis[J]. Journal of Biological Chemistry，2002，277（44）：41987-42002.

[3]Morgan D O. Cyclin-dependent kinases：engines，clocks and microprocessors[J]. Annu Rev Cell Dev Biol，1997，13：261-291.

[4]de Veylder L，Beeckman T，Beemster G T，et al. Functional analysis of cyclin-dependent kinase inhibitors of Arabidopsis[J]. The Plant Cell，2001，13（7）：1653-1668.

[5]Zhou Y M，Wang H，Gilmer S，et al. Effects of co-expressing the plant CDK inhibitor ICK1 and D-type cyclin genes on plant growth，cell size and ploidy in Arabidopsis thaliana[J]. Planta，2003，216（4）：604-613.

[6]de Clercq A，Inze D. Cyclin-dependent kinase inhibitors in yeast，animals and plants：a functional comparison[J]. Crit Rev Biochem Mol Biol，2006，41：293-313.

[7]Verkest A，Manes C L，Vercruysse S，et al. The cyclin-dependent kinase inhibitors KRP2 controls the onset of the endoreduplication cycle during Arabidopsis leaf development through inhibition of mototic CDKA;1 kinase complexes[J]. Plant Cell，2005，17（6）：1723-1736.

[8]Soichi I，Masaaki U. Cell-cycle control and plant development[J]. International Review of Cell and Molecular Biology，2011，291：227-261.

[9]李 芳，羅 軍，許會芬，等. 西農(nóng)薩能羊MAT基因的原核表達及多克隆抗體制備[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2014，42（12）：1-6，12.

[10]張 鈺，李亞會，屠唯一，等. 擬南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表達及多克隆抗體的制備[J]. 上海師范大學學報（自然科學版），2013，42（4）：378-383.

[11]余璐璐，龔絨雪，呂林濤，等. 擬南芥氰丙氨酸合酶CYS-C1基因擴增及多克隆抗體制備[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2017，33（6）：1235-1241.

[12]許 君，喬 帥，常 嵐，等. 苦瓜核糖體失活蛋白MAP30的原核表達與抗體制備[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學學報，2009，43（5）：552-556.

[13]單麗偉，唐如春，劉三陽. 小麥種子過氧化物酶WP1基因的原核表達、純化及多克隆抗體制備[J]. 生物工程學報，2011，27（1）：26-30.

[14]鄒向陽，李連宏. 細胞周期調控與腫瘤[J]. 國際遺傳學雜志，2006，29（1）：70-73.白 雪，張慧莉，黃 沖，等. 解淀粉芽孢桿菌草酸脫羧酶基因的克隆、原核表達與活力測定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2019，47（12）：66-70.