楊瀾 王愛(ài)華 石樂(lè)娟

摘要：黑喉石斛在自然條件下從播種到開(kāi)花需要3年左右的時(shí)間。為了研究黑喉石斛的開(kāi)花過(guò)程，縮短開(kāi)花年限，采用組織培養(yǎng)方法研究不同因素對(duì)黑喉石斛試管內(nèi)花芽誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，（1）植株的成熟度與花芽誘導(dǎo)率相關(guān)性明顯;（2）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑TDZ+PP333組合可誘導(dǎo)黑喉石斛花芽形成，以0.2 mg/L TDZ+0.3 mg/L PP333組合誘導(dǎo)90 d苗齡的黑喉石斛幼苗試管開(kāi)花率最高，為40.00%;（3）TDZ+PP333+NAA組合有利于叢生芽的增殖和試管內(nèi)壯苗培養(yǎng)，以比例1 ∶ 5 ∶ 2和1 ∶ 8 ∶ 4的處理效果最佳。由此推測(cè)黑喉石斛試管內(nèi)開(kāi)花不僅跟植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度有關(guān)，還與植株的生理狀態(tài)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：黑喉石斛;植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑;組織培養(yǎng);花芽誘導(dǎo)

中圖分類(lèi)號(hào)： S682.310.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0190-03

黑喉石斛（Dendrobium ochreatum）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬多年生附生草本植物，也是珍貴的藥用石斛[1]。花期4～5月，花大且顏色艷麗，具有良好的觀賞價(jià)值。石斛幼年期較長(zhǎng)，從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到開(kāi)花需要3年，受基因型及生長(zhǎng)環(huán)境條件影響而有所差異。黑喉石斛的開(kāi)花特性有別于其他同屬石斛，在成熟植株當(dāng)年新生長(zhǎng)出來(lái)的嫩莖上就能開(kāi)花，無(wú)需等到第2年再開(kāi)花，是研究石斛提早開(kāi)花機(jī)制的理想材料。成花誘導(dǎo)是高等植物開(kāi)花的基礎(chǔ)，決定著植物的開(kāi)花時(shí)間。通過(guò)組織培養(yǎng)的方法可以實(shí)現(xiàn)植物在試管內(nèi)完成成花誘導(dǎo)、花發(fā)育過(guò)程。該方法重復(fù)性強(qiáng)且不受季節(jié)和地域的限制，為研究植物開(kāi)花的生理及分子生物學(xué)機(jī)制提供了一個(gè)理想的試驗(yàn)系統(tǒng)。蘭花試管開(kāi)花誘導(dǎo)條件具有很強(qiáng)的品種差異性[2]。植物開(kāi)花是多種因素綜合作用的結(jié)果，眾多研究表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[3-4]、氮磷鎂離子濃度和培養(yǎng)溫度[5]、植物材料成熟程度[6]等是影響石斛試管內(nèi)開(kāi)花的主要因素。植物材料成熟程度和植物激素對(duì)植物試管開(kāi)花起著重要作用[6-7]。劉義存等研究指出，不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)試管中花芽形成的誘導(dǎo)效果有明顯的差別，其中細(xì)胞分裂素的作用最突出，而生長(zhǎng)素次之[8]。目前利用組織培養(yǎng)技術(shù)已成功獲得了霍山石斛[9]、春石斛[10]、鐵皮石斛[11]試管開(kāi)花苗。

通過(guò)組織培養(yǎng)的方式獲得黑喉石斛的試管開(kāi)花材料是研究其開(kāi)花生理及分子機(jī)制的有效方法，本試驗(yàn)以單葉幼苗期（HH1）、原球莖晚期（HH2）、原球莖早期（HH3）黑喉石斛為研究材料，研究植物成熟度及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[噻苯?。╰hidiazuron，簡(jiǎn)稱(chēng)TDZ）、多效唑（paclobutraeol，簡(jiǎn)稱(chēng)PP333）]對(duì)其試管內(nèi)花芽誘導(dǎo)的影響，以期探索出適宜的誘導(dǎo)時(shí)期和誘導(dǎo)培養(yǎng)基，為進(jìn)一步建立試管苗誘導(dǎo)開(kāi)花體系，研究其開(kāi)花機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 不同成熟度無(wú)菌材料的培養(yǎng)

試驗(yàn)時(shí)間為2016年5月，試驗(yàn)在貴州省園藝研究所蘭花組培室進(jìn)行。試驗(yàn)材料采自于貴州省園藝研究所蘭花種質(zhì)資源溫室，將采回的1個(gè)成熟未開(kāi)裂的黑喉石斛蒴果用蘸有75%乙醇的棉球擦拭表面，再用0.1%氯化汞溶液浸泡 30 min，最后用無(wú)菌水浸泡沖洗5次，將蒴果表面的氯化汞溶液清洗干凈。之后在無(wú)菌器皿中將果莢從中間切開(kāi)，將果莢內(nèi)的種子播種于添加茶乙酸（NAA）的1/2MS（不含瓊脂和蔗糖）培養(yǎng)基中，果莢內(nèi)剩余的種子放入無(wú)菌eppendroff管中保存?zhèn)溆?，每間隔10 d播種1次，共播種3次。分別經(jīng)過(guò)50、40、30 d培養(yǎng)，獲得3種成熟度的材料，分別為單葉幼苗期材料HH1、原球莖晚期材料HH2、原球莖早期材料HH3。

1.2 黑喉石斛試管內(nèi)花芽誘導(dǎo)

以HH1、HH2、HH3黑喉石斛為試驗(yàn)材料，采用不同濃度的TDZ+PP333組合進(jìn)行黑喉石斛花芽誘導(dǎo)處理（表1），培養(yǎng)60 d后轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基中。所有培養(yǎng)基中附加香蕉 100 g/L、蘋(píng)果50 g/L、胡蘿卜50 g/L，將pH值調(diào)至5.4，培養(yǎng)條件：溫度為（23±2） ℃，光照度為1 000～1500 lx，光照時(shí)間為 11 h/d，且以不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為對(duì)照（CK）培養(yǎng)基，培養(yǎng)90 d后觀察并統(tǒng)計(jì)試管內(nèi)花芽數(shù)量及組培苗的生長(zhǎng)情況，計(jì)算花芽誘導(dǎo)率，花芽誘導(dǎo)率=分化花芽的植株數(shù)/所有植株 數(shù)×100%。

1.3 黑喉石斛繼代培養(yǎng)1次后進(jìn)行花芽誘導(dǎo)

將HH1、HH2、HH3的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)入1/2MS繼代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60 d后再轉(zhuǎn)入B1～B10及無(wú)激素的對(duì)照（CK）培養(yǎng)基中（表2）。所有培養(yǎng)基中附加香蕉100 g/L、蘋(píng)果50 g/L、胡蘿卜50 g/L以及活性炭， 將pH值調(diào)至5.4。培養(yǎng)條件：溫度為（23±2） ℃，光照度為 1 000～1 500 lx，光照時(shí)間為11 h/d。培養(yǎng)90 d后統(tǒng)計(jì)試管內(nèi)花芽數(shù)量及組培苗的生長(zhǎng)情況，計(jì)算花芽誘導(dǎo)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑喉石斛的無(wú)菌播種

為獲得不同生長(zhǎng)時(shí)期的黑喉石斛無(wú)菌材料，本試驗(yàn)分3個(gè)階段將黑喉石斛種子播種于1/2 MS+NAA萌發(fā)培養(yǎng)基上。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)30 d左右的培養(yǎng)，種子可萌發(fā)形成原球莖，萌發(fā)率超過(guò)99%;經(jīng)過(guò)50 d的培養(yǎng)，可分化生長(zhǎng)出莖和葉。

2.2 黑喉石斛試管內(nèi)花芽誘導(dǎo)及生長(zhǎng)情況

從表3可以看出，HH1、HH2、HH3黑喉石斛經(jīng)過(guò)6種組合的TDZ+PP333誘導(dǎo)處理60 d后，處于單葉幼苗期的材料及經(jīng)過(guò)A1（TDZ 0.05 mg/L+PP333 0.5 mg/L）、A2（TDZ 0.1 mg/L+PP333 0.5 mg/L）處理后轉(zhuǎn)入1/2 MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)90 d后出現(xiàn)花芽，花芽誘導(dǎo)率分別為5%、7%，其他處理及對(duì)照培養(yǎng)基中均未發(fā)現(xiàn)花芽。HH1、HH2、HH3經(jīng)過(guò)處理后莖和葉營(yíng)養(yǎng)器官的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制作用，表現(xiàn)為植株矮小，葉片小且數(shù)量少，莖長(zhǎng)度縮短，生長(zhǎng)遲緩。隨著TDZ與PP333濃度的不斷升高，對(duì)植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)TDZ濃度達(dá)到0.2 mg/L時(shí)，葉片的分化受抑制，植株無(wú)法正常生長(zhǎng)。PP333使HH1、HH2、HH3莖長(zhǎng)度縮短，植株矮小。A1～A6 處理均在不同程度上影響黑喉石斛根、莖、葉的生長(zhǎng)。無(wú)激素處理的對(duì)照植株相對(duì)于激素處理的植株生長(zhǎng)速度更快，植株健壯。

2.3 繼代培養(yǎng)對(duì)黑喉石斛花芽誘導(dǎo)的影響

從表4可以看出，在B1～B10及對(duì)照培養(yǎng)基中，HH1、HH2、HH3的繼代苗在試管內(nèi)生長(zhǎng)情況不盡相同。低濃度的TDZ（0.1 mg/L）與PP333（0.3 mg/L）組合B1不僅無(wú)法誘導(dǎo)HH1、HH2、HH3的繼代苗花芽形成，而且叢生芽少，植株生長(zhǎng)緩慢。B6（TDZ 0.2 mg/L+PP333 0.3 mg/L）、B8（TDZ 0.5 mg/L+PP333 0.5 mg/L）、B10（TDZ 0.2 mg/L）3種處理均能誘導(dǎo)HH1、HH2、HH3的繼代苗形成花芽。B6處理HH1繼代苗的花芽誘導(dǎo)率最高為40%，而B(niǎo)8、B10處理的花芽誘導(dǎo)率均低于10%（表5），且B8處理下容易出現(xiàn)畸形植株。其他的誘導(dǎo)培養(yǎng)基均無(wú)法誘導(dǎo)花芽生成，但對(duì)試管內(nèi)壯苗、叢生芽增殖有一定的促進(jìn)作用。B2、B3處理植株的叢生芽增殖率較高，可達(dá)到3～5倍;植株莖干增粗，葉片變寬，根部變粗且有根毛，生長(zhǎng)健壯;適合3～4個(gè)月苗齡的黑喉石斛叢生芽誘導(dǎo)及壯苗培養(yǎng)。而B(niǎo)7、B8、B9處理中雖然也有叢生芽的增殖，但畸形苗較多，且部分葉片黃化，莖干基部出現(xiàn)不同程度的褐化。對(duì)照培養(yǎng)基中無(wú)花芽出現(xiàn)。

3 結(jié)論與討論

試管內(nèi)的石斛苗要完成營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，除了要有適宜的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件之外，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效積累也是決定其花芽分化是否成功的關(guān)鍵因素之一[12]。本試驗(yàn)中3種成熟度黑喉石斛材料，單葉幼苗期材料HH1，經(jīng)過(guò)A1（TDZ 0.05 mg/L+PP333 0.5 mg/L）、A2（TDZ 0.1 mg/L+PP333 0.5 mg/L）處理后轉(zhuǎn)入1/2 MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)90 d后出現(xiàn)花芽，花芽誘導(dǎo)率分別為5%、7%，后期植株莖伸長(zhǎng)及葉片生長(zhǎng)受到明顯抑制，可能是由于石斛材料成熟度較低的原因。原球莖材料HH2、HH3未誘導(dǎo)出花芽。經(jīng)過(guò)60 d繼代培養(yǎng)的HH1、HH2、HH3材料均被B6處理誘導(dǎo)出花芽，誘導(dǎo)率分別為40.00%、21.32%、13.32%。B8、B10培養(yǎng)基誘導(dǎo)花芽率

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)及濃度也是成功誘導(dǎo)石斛試管內(nèi)開(kāi)花的重要因素之一，尤其細(xì)胞分裂素的種類(lèi)對(duì)于石斛花芽分化的作用極為顯著[13]。6-芐氨基嘌呤（6-BA）、2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-D）、噻苯?。═DZ）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑被研究者們廣泛應(yīng)用于蘭花試管開(kāi)花研究中，但不同蘭花適宜的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)跟用量存在較大差異。陳肖英發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中單獨(dú)添加低濃度的TDZ能成功誘導(dǎo)出霍山石斛花芽[14]。本試驗(yàn)中單獨(dú)添加低濃度的TDZ（0.2 mg/L）可誘導(dǎo)3～4個(gè)月苗齡的黑喉石斛苗試管開(kāi)花，但誘導(dǎo)率較低，試管內(nèi)僅見(jiàn)少量花芽。TDZ與PP333能夠影響石斛的形態(tài)建成，促進(jìn)其試管苗從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)，在誘導(dǎo)蘭花植物春石斛、鐵皮石斛以及細(xì)莖石斛試管開(kāi)花的研究中被證實(shí)有著重要作用[12，15-16]。李杰等發(fā)現(xiàn)，TDZ和PP333組合能誘導(dǎo)霍山石斛開(kāi)花[9]。本試驗(yàn)中低比例的TDZ和PP333組合A1（1 ∶ 10）、A2（1 ∶ 5）可誘導(dǎo)處理處于單葉幼苗期黑喉石斛試管開(kāi)花。B6（TDZ ∶ PP333=2 ∶ 3）、B8（TDZ ∶ PP333=1 ∶ 1）培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)3～4個(gè)月苗齡的黑喉石斛試管苗開(kāi)花。隨著植株成熟度的增加，開(kāi)花率逐漸增加，表現(xiàn)為HH1繼代苗（40.00%）>HH2繼代苗（21.32%）>HH3繼代苗（13.32%）。未添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的對(duì)照均不能誘導(dǎo)黑喉石斛形成花芽。TDZ+PP333+NAA組合雖未能誘導(dǎo)花芽出現(xiàn)，但對(duì)3～4個(gè)月苗齡的黑喉石斛試管苗叢生芽的增殖及壯苗培養(yǎng)有積極的促進(jìn)作用，其中以比例1 ∶ 5 ∶ 2和 1 ∶ 8 ∶ 4 的處理效果最佳。

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