袁銳 方蘋 倪金俤

摘要：對(duì)我國江蘇地區(qū)養(yǎng)殖錦鯉暴發(fā)性鯉皰疹病毒?。╧oiherpes virus disease，簡稱KHVD）的病原進(jìn)行鑒定。2018年5月，江蘇省一錦鯉養(yǎng)殖場暴發(fā)不明原因傳染疾病，病魚肝、脾、腎臟中未分離到細(xì)菌。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)大量球狀病毒粒子。提取自然發(fā)病魚的鰓、腎、脾、肝組織DNA作為模板進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示為陽性。Blast比對(duì)結(jié)果顯示，擴(kuò)增序列與錦鯉瘡疹病毒（koi herpesvirus，簡稱KHV）胸苷激酶（thymidine kinase，簡稱TK）基因和KHV DNA聚合酶（SPH）基因核苷酸序列同源性為99%。對(duì)病毒株的TK基因全長序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，證實(shí)該毒株屬于KHV亞洲型毒株。

關(guān)鍵詞：錦鯉;錦鯉皰疹病毒;病毒鑒定;系統(tǒng)進(jìn)化分析

中圖分類號(hào)：S941.41+2?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0200-04

鯉皰疹病毒?。╧oiherpes virus disease，簡稱KHVD）是由錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，簡稱KHV）引起錦鯉和鯉魚及其普通變種的一種急性、接觸性傳染病，該病被我國農(nóng)業(yè)部列為二類動(dòng)物疫病，對(duì)鯉魚和錦鯉的養(yǎng)殖危害極大，致死率高達(dá)80%～100%[1～3]。其病原KHV是雙鏈DNA病毒，基因組全長為295 kb[4]，編碼164個(gè)開放閱讀框，KHV有多種基因型，目前已完成全基因組測序的分離株有日本株（KHV-J）、美國株（KHV-U）、以色列株（KHV-I）以及在我國分離的KHV-GZ11，其中，KHV-U、KHV-I和KHV-GZ11的相似性較高[4-5]。目前，我國國內(nèi)報(bào)道并成功分離的KHV毒株有遼寧株（KHV-cj）、廣州株（KHV-GZ1301）、黑龍江株（KHV-hlj）等[6-8]?，F(xiàn)有研究表明，KHV是一種具有高傳染性、高發(fā)病率和高死亡率的病毒性疾病，可感染任何年齡的錦鯉與鯉魚，其典型臨床癥狀是行動(dòng)遲緩、食欲不振、體表尤其是皮膚和鰭基部出現(xiàn)出血癥狀，嚴(yán)重者眼球凹陷、鰓蒼白并伴有中度至嚴(yán)重的壞死，感染后7～10 d開始出現(xiàn)死亡[9-11]。由于KHVD流行范圍廣，危害大，已經(jīng)引起我國及世界多個(gè)國家的高度重視[12]。

2018年5月，江蘇省蘇州地區(qū)一錦鯉養(yǎng)殖場發(fā)生大面積死亡，發(fā)病魚體表黏液明顯增多，眼球凹陷，全身體表多處出血，尤其是鰭基部嚴(yán)重出血，剖檢后可見病魚脾臟、腎臟明顯腫大，然而從內(nèi)臟器官中未能分離檢測到細(xì)菌，鏡檢也未見寄生蟲。根據(jù)病魚的臨床特征及發(fā)病時(shí)間初步判斷該病由KHV引起，為進(jìn)一步驗(yàn)證導(dǎo)致錦鯉大量死亡的原因，根據(jù)我國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 7212.1—2011《鯉皰疹病毒檢測方法第1部分：錦鯉皰疹病毒》設(shè)計(jì)檢測引物進(jìn)行病毒PCR檢測，對(duì)病灶部位的電鏡觀察顯示。根據(jù)胸苷激酶（thymidine kinase，簡稱TK）基因全長序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，研究其株型。本研究首次報(bào)道KHV在我國華東地區(qū)暴發(fā)流行。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集

患病魚于2018年5月采自江蘇省某觀賞魚養(yǎng)殖場，體長50 cm左右，充氧打包運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

病毒DNA提取試劑盒、腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司;PCR Mix預(yù)混液購自TaKaRa公司;戊二醛等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)菌學(xué)檢查

對(duì)病魚進(jìn)行解剖觀察，同時(shí)在無菌操作條件下，從肝臟、脾臟、腎臟取樣進(jìn)行BHI平板、血平板劃線分離細(xì)菌，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察病菌生長狀況，待菌落形成后進(jìn)行菌落純化和鑒定。

1.4 電鏡觀察

以去離子水配制2.5%的戊二醛固定液，取鰓、腎、肝、脾組織切成薄片，浸泡于戊二醛固定液中固定，在用透射電鏡觀察前，將組織取出切成0.5 cm×0.5 cm大小的小塊，用透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.5 PCR鑒定

病魚的組織DNA提取按照病毒DNA提取試劑盒的說明進(jìn)行操作。PCR檢測所用引物及檢測方法參照我國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 7212.1—2011《鯉皰疹病毒檢測方法第1部分：錦鯉皰疹病毒》進(jìn)行。引物由TaKaRa公司合成，引物序列見表1，TK基因的擴(kuò)增體系為 50 μL，反應(yīng)體系包括25 μL Mix預(yù)混液，2.5 μL DNA模板，引物各0.5 μL（濃度為 100 μmol/L），21.5 μL ddH2O，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性1 min，51 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，預(yù)期得到約409 bp的PCR產(chǎn)物。SPH基因的擴(kuò)增體系為100 μL，反應(yīng)體系包括50 μL Mix預(yù)混液，5 μL DNA模板，引物各1 μL（濃度為 100 μmol/L），43 μL ddH2O，擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性30 s;94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，預(yù)期得到約292 bp的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，將測得的序列登錄美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

2 結(jié)果與分析

2.1 解剖及病原檢查

患病錦鯉體長約50 cm，魚體明顯缺乏活力，食欲減退，體表黏液增多，鰓絲發(fā)白（圖1），病魚鰭基部及體表出血嚴(yán)重（圖2），解剖后發(fā)現(xiàn)脾臟等內(nèi)臟腫大，其臨床癥狀類似于KHV感染。制作鰓絲水浸片進(jìn)行寄生蟲的顯微鏡檢查，未觀察到寄生蟲。

2.2 病原菌的分離

從病魚的肝、脾、腎組織中未能分離到病原菌。

2.3 電鏡觀察

取病魚的鰓、腎、脾、肝組織進(jìn)行透射電鏡觀察，結(jié)果表明，在腎臟和脾臟組織中，可明顯地觀察到大量成熟或不成熟病毒粒子（圖3、圖4），形狀為圓形，有囊膜結(jié)構(gòu)，其直徑在200 nm左右，呈現(xiàn)出典型的皰疹病毒特征，由此證實(shí)該病毒對(duì)于魚體的感染。

2.4 PCR鑒定

根據(jù)我國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SC/T 7212.1—2011）提供的PCR檢測方法對(duì)發(fā)病魚的鰓、腎、肝、脾進(jìn)行KHV的TK和SPH基因特異性PCR擴(kuò)增，均檢測到預(yù)期大小的片段（圖5），對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，經(jīng)NCBI比對(duì)，序列與KHV的TK和SPH基因序列具有99%的同源性，將該毒株命名為KHV-JS。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)KHV-JS樣進(jìn)行TK全長序列擴(kuò)增，將1 000 bp左右的目的片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行克隆測序。結(jié)果顯示，分離株的TK基因全長為997 bp，將測得序列與GenBank中登錄的KHV序列進(jìn)行比較，其與KHV-A1的同源性為100%。依據(jù)鄰接法利用MEGA 7.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹，從圖6可以看出，本試驗(yàn)中鑒定的KHV-JS株與各個(gè)亞洲株型聚在了一起，為典型KHV亞洲株型。

3 討論

錦鯉皰疹病毒病是一種具有高傳染性、高發(fā)病率和高死亡率的病毒性疾病，給我國及世界多個(gè)國家的錦鯉及鯉魚養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織水生動(dòng)物疫病名錄收錄[15]。KHVD一般發(fā)病于春秋季節(jié)，高溫夏季、低溫冬季不發(fā)病，發(fā)病溫度為18～28 ℃[16]，主要感染各個(gè)生長階段的錦鯉和鯉魚，相關(guān)研究表明，金魚[12]、異育銀鯽[17]等魚類也有可能感染KHV，并可能作為病毒攜帶者，但是到目前為止還沒有除錦鯉和鯉魚以外的其他魚類感染KHV導(dǎo)致發(fā)病的報(bào)道。鯉魚是我國的主要淡水養(yǎng)殖魚類之一，錦鯉則是我國最主要的觀賞魚養(yǎng)殖品種之一，一旦暴發(fā)錦鯉皰疹病毒病，高達(dá)100%的死亡率將給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖和觀賞魚產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，亟須開展對(duì)該病的流行病學(xué)調(diào)查和防控研究。

目前，我國已有多地流行和暴發(fā)過KHVD，主要集中在廣東、東北和四川等地區(qū)，國內(nèi)報(bào)道并成功分離的KHV毒株有廣州株（KHV-GZ11和KHV-GZ1301）、遼寧株（KHV-cj）、黑龍江株（KHV-hlj），其中，除廣州株KHV-GZ11屬于歐洲株型外，其他毒株均屬于亞洲株型。本研究首次報(bào)道KHVD在我國華東地區(qū)的暴發(fā)，并且成功分離鑒定了KHV-JS株。江蘇省是我國淡水魚養(yǎng)殖大省，全省水產(chǎn)養(yǎng)殖面積達(dá)到

63.21 hm2，其中淡水養(yǎng)殖總面積為43.98 hm2，水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)328.1萬t，主要養(yǎng)殖青魚（Mylopharyngodon piceus）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）、鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙魚（Aristichthys nobilis）、鯉魚（Cyprinus carpio）、鯽魚（Carassius auratus）等，觀賞魚養(yǎng)殖規(guī)模達(dá)到86 234萬尾，占全國總規(guī)模的20.73%，錦鯉作為一種重要的觀賞魚類，深受消費(fèi)者喜愛，具有廣闊的市場前景，然而鯉皰疹病毒病的高死亡率以及具有潛伏感染的特性[18]，嚴(yán)重威脅著錦鯉和鯉魚養(yǎng)殖業(yè)的安全。

疫苗是控制病毒性疾病最有效的途徑，在一些常見的水產(chǎn)動(dòng)物病毒病上應(yīng)用廣泛。減毒疫苗以及改良的活疫苗都被證明具有顯著的抗病效果，但是其潛在的安全隱患仍然令人擔(dān)憂，一系列不安全因素阻礙了其在生產(chǎn)上的應(yīng)用[19]。相比傳統(tǒng)疫苗，DNA疫苗更安全，沒有毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，是病毒疫苗未來的發(fā)展趨勢，由于不同地區(qū)KHV毒株基因型具有一定的差異性，因此對(duì)不同來源毒株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析以及株型鑒定，對(duì)于DNA疫苗的研制具有重要意義。Kurita等證明，來自亞洲和歐洲的隔離群有著明顯的基因差異，可通過對(duì)TK基因全長序列的測定將KHV毒株區(qū)分為歐洲型和亞洲型[13]。本研究獲得KHV-JS的TK基因全長序列為997 bp，經(jīng)MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，表明KHV-JS屬于亞洲株型。本研究首次從我國華東地區(qū)分離鑒定1株KHV，可為KHV起源進(jìn)化、分類以及疾病診斷和防控提供重要依據(jù)。

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