張婷 徐巖巖 李潔

摘要：為研究植物酸對(duì)煙曲霉的抑制作用，以煙曲霉菌為試驗(yàn)材料，通過測(cè)定植物酸的最小抑菌濃度（MIC），以MIC和1/2MIC的植物酸液體培養(yǎng)煙曲霉，觀察煙曲霉菌絲生長(zhǎng)和分生孢子頂囊形態(tài)變化;并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，初步探討其抑菌機(jī)制。結(jié)果表明，植物酸具有抑制煙曲霉生長(zhǎng)的作用，最小抑菌濃度為20 μL/mL。在1/2MIC植物酸培養(yǎng)煙曲霉時(shí)，菌絲生長(zhǎng)受到抑制，菌絲形態(tài)及分生孢子頂囊部分發(fā)育不完全。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，差異基因代謝通路主要集中在代謝過程，其次是遺傳信息處理。涉及上調(diào)基因數(shù)目較多的代謝通路主要包括氨基酸生物合成、核糖體、氧化磷酸化和氨酰tRNA生物合成。涉及下調(diào)基因數(shù)目較多的代謝通路主要是代謝通路，其次是次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、抗生素生物合成以及星形孢菌素生物合成。推測(cè)植物酸可能是通過干擾煙曲霉生長(zhǎng)過程中的多個(gè)信號(hào)通路及多個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)抑制作用。

關(guān)鍵詞：植物酸;煙曲霉菌;最小抑菌濃度;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;抑菌機(jī)制

中圖分類號(hào)： S482.2+92 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0287-06

植物酸是制備活性炭過程中產(chǎn)生的煙氣經(jīng)冷凝回流后收集得到的液體，它的主要成分為酚類和有機(jī)酸，同時(shí)含有少量無機(jī)物[1]。近年來，植物酸廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品等行業(yè)。研究表明，植物酸有較好的抑菌作用?？艹傻扔镁频闹参锼徇M(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種病原菌均有一定的抑制作用[2]。徐巖巖等將植物酸用于平菇細(xì)菌性褐斑病防治，試驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度植物酸既能有效控制細(xì)菌病害，又能促進(jìn)平菇菌絲的生長(zhǎng)[3]。易允喻等采用D值計(jì)算法得出苦杏殼植物酸對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度[4]。鑒于化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和健康的危害，尋找純天然、安全、綠色的生物農(nóng)藥迫在眉睫，植物酸是一種純天然殺菌藥物，越來越受到人們重視。

煙曲霉菌是一種常見的病原真菌，對(duì)人、畜及作物均有嚴(yán)重危害，多采用化學(xué)藥劑防治[5-8]，尚未見關(guān)于植物酸的抑煙曲霉菌及其抑制機(jī)制的研究報(bào)道。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)用于抑菌機(jī)制研究[9-10]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室在研究珊瑚狀猴頭菌新品種雪玉松茸（Hericium erinaceus）時(shí)，獲得1株內(nèi)生煙曲霉菌。從保證食品安全，尋找安全、抗真菌活性天然藥物的角度出發(fā)，本試驗(yàn)研究植物酸對(duì)煙曲霉菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子頂囊形態(tài)的影響，并通過轉(zhuǎn)錄組分析，對(duì)植物酸抑制煙曲霉菌的機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物酸由河北綠天生物科技有限責(zé)任公司提供;煙曲霉菌為筆者所在實(shí)驗(yàn)室從雪玉松茸食用真菌中分離獲得，經(jīng)分子鑒定為煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）;陽(yáng)性藥物氟康唑，購(gòu)自藥店。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸液的制備 煙曲霉菌在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，用含0.1% 吐溫80的生理鹽水沖洗培養(yǎng)基表面，經(jīng)無菌紗布過濾除去菌絲，7 000 r/min 離心2 min，棄上清，經(jīng)無菌生理鹽水洗2次后，離心棄上清，用生理鹽水重懸孢子，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整孢子懸液濃度為100萬(wàn)～500萬(wàn)CFU/mL，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 瓊脂稀釋培養(yǎng)法測(cè)定植物酸對(duì)煙曲霉的最小抑菌濃度 在PDA固體培養(yǎng)基中加入不同劑量的植物酸，濃度分別為5、10、15、20 μL/mL，待冷卻至室溫后倒平板，于平板中央注入5 μL孢子懸液，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組（加氟康唑）和空白對(duì)照組（加無菌水），均設(shè)置3個(gè)平行。35 ℃恒溫連續(xù)培養(yǎng)4 d，觀察并記錄菌落直徑，PDA固體培養(yǎng)基中無菌落生長(zhǎng)的植物酸濃度即為最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.3 植物酸對(duì)煙曲霉菌菌絲質(zhì)量的影響 采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng)，加入植物酸，使其終濃度為1/2MIC，加入孢子懸液，以加無菌水的處理為空白對(duì)照組，加氟康唑的處理為陽(yáng)性對(duì)照組，均設(shè)置3個(gè)平行。于35 ℃、130 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄菌絲球生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)液顏色變化，培養(yǎng)4 d后，過濾菌絲用無菌水沖洗后，烘干至恒質(zhì)量，測(cè)量菌絲干質(zhì)量。

1.2.4 植物酸對(duì)煙曲霉菌分生孢子梗形態(tài)的影響 用牙簽挑取處理組與空白對(duì)照組菌絲于載玻片上，用乳酸酚棉藍(lán)染色后，置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察，比較菌絲形態(tài)的變化。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 Trizol法提取終濃度為1/2MIC的植物酸處理組及空白對(duì)照組煙曲霉菌總RNA，分別標(biāo)記為處理組1-1、處理組1-2、處理組1-3，對(duì)照組1-1、對(duì)照組1-2、對(duì)照組1-3（表1）。測(cè)定樣品濃度，質(zhì)檢合格后，送交深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)差異表達(dá)基因（DEG）進(jìn)行基因的木體論（GO）功能及代謝路徑（Pathway）功能分析，分析樣品組間基因表達(dá)的差異。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度植物酸對(duì)煙曲霉菌的抑制作用

在培養(yǎng)基中分別加入5、10、15、20 μL/mL植物酸，以加氟康唑的處理為陽(yáng)性對(duì)照組，以加無菌水的處理為空白對(duì)照組。35 ℃培養(yǎng)4 d后，測(cè)定煙曲霉菌菌落直徑。發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組的生長(zhǎng)速度顯著（P<0.05）高于植物酸處理組，當(dāng)植物酸濃度為20 μL/mL時(shí)，煙曲霉菌生長(zhǎng)完全受到抑制，則 20 μL/mL 為最小抑菌濃度（圖1）。

2.2 植物酸對(duì)煙曲霉菌菌絲質(zhì)量的影響

在液體培養(yǎng)基中， 加入終濃度為1/2MIC的植物酸，以加無菌水的處理為空白對(duì)照組，加氟康唑的處理為陽(yáng)性對(duì)照組。接入孢子懸液，于35 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)4 d，測(cè)定菌絲干質(zhì)量，結(jié)果見表2。

由表2可知，植物酸處理組菌絲干質(zhì)量明顯低于空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，分別為空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的86%、9.4%，并且與對(duì)照組相比，植物酸處理組孢子萌發(fā)較晚，且其培養(yǎng)液及菌絲球顏色并未呈現(xiàn)對(duì)照組的黑褐色，表明植物酸抑制了煙曲霉菌的生長(zhǎng)及色素的合成。

2.3 植物酸對(duì)煙曲霉菌菌絲及分生孢子梗形態(tài)的影響

由圖2可知，將加入5、10 μL/mL植物酸的處理組與對(duì)照組的煙曲霉菌用乳酸酚棉藍(lán)染色，顯微觀察煙曲霉菌的菌絲及孢子形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物酸處理組與對(duì)照組存在明顯差異。對(duì)照組菌絲中分生孢子頭數(shù)量較多且孢子頂囊呈圓形產(chǎn)孢數(shù)量較多（圖2-A、圖2-B），植物酸處理組中分生孢子頭數(shù)量隨植物酸濃度的增加逐漸減少，10 μL/mL植物酸處理組孢子頂囊發(fā)育不完全（圖2-E、圖2-F）。

2.4 轉(zhuǎn)錄組分析

根據(jù)差異基因檢測(cè)結(jié)果，對(duì)其GO功能進(jìn)行分類和富集分析。GO分為生物學(xué)過程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）。結(jié)果顯示，在生物學(xué)過程中代謝過程（metabolic process）、細(xì)胞過程（cellular process）和單一生物過程（single-organism process）富集到較多的DEG; 在細(xì)胞組分中細(xì)胞（cell）、 細(xì)胞組分（cell part）、膜（membrane）、細(xì)胞器（organelle）、膜組成（membrane part）等富集到的DEG較多;在分子功能中富集到的DEG較多的是催化作用（catalytic activity）和結(jié)合作用（binding）（圖3）。

進(jìn)一步對(duì)GO功能對(duì)應(yīng)的差異基因上調(diào)、下調(diào)進(jìn)行分析。結(jié)果（圖4）顯示，顯著上調(diào)基因主要集中在細(xì)胞組分中的細(xì)胞（cell）、細(xì)胞組分（cell part）、細(xì)胞器（organelle）、細(xì)胞器組分（organelle part）和大分子復(fù)合物（macromolecular complex）;顯著下調(diào)基因主要集中在生物學(xué)過程中的代謝過程（metabolic process）、細(xì)胞過程（cellular process）和單一生物過程（single-organism process），以及分子功能中的催化作用（catalytic activity）、結(jié)合作用（binding）、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（transporter activity）和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（nucleic acid binding transcription factor activity）。

根據(jù)差異基因檢測(cè)結(jié)果，對(duì)其進(jìn)行KEGG生物通路分類以及富集分析，通路分類結(jié)果詳見圖5，富集通路對(duì)應(yīng)的差異表達(dá)基因上調(diào)、下調(diào)詳見圖6。差異基因代謝通路主要包括細(xì)胞過程（cellular processes）、環(huán)境信息處理（environmental information processing）、遺傳信息處理（genetic information processing）、代謝（metabolism）、有機(jī)系統(tǒng)（organismal systems）。結(jié)果顯示，差異基因代謝通路主要集中在代謝過程，所涉及到的Unigene數(shù)目高達(dá)3648條。其次是遺傳信息處理，涉及885條Unigene。涉及上調(diào)基因數(shù)目較多的代謝通路主要包括氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）、核糖體（ribosome）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）和氨酰tRNA生物合成（aminoacy-tRNA biosynthesis）。說明植物酸促使蛋白質(zhì)合成過程加強(qiáng)。涉及下調(diào)基因數(shù)目較多的代謝通路主要是代謝通路（metabolic pathways），其次是次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、抗生素生物合成（biosynthesis of antibiotics）以及星形孢菌素生物合成（staurosporine biosynthesis）。

3 討論與結(jié)論

植物酸是一種純天然殺菌藥物，對(duì)植物病原菌、霉菌和細(xì)菌均有很好的生長(zhǎng)抑制活性[11-14]，本研究結(jié)果表明，植物酸能夠改變煙曲霉菌的菌絲形態(tài)，減少或抑制孢子的生成和產(chǎn)率，從而抑制煙曲霉菌的生長(zhǎng)。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)植物酸處理抑制煙曲霉菌生長(zhǎng)的樣品進(jìn)行研究，差異表達(dá)基因GO功能分析結(jié)果顯示，涉及上調(diào)基因數(shù)目較多的代謝通路主要包括氨基酸生物合成、核糖體、氧化磷酸化和氨酰tRNA生物合成。推測(cè)可能是植物酸的有效成分導(dǎo)致蛋白質(zhì)受損，從而代償性地促進(jìn)煙曲霉菌蛋白質(zhì)的合成過程以滿足其生長(zhǎng)需要。下調(diào)基因主要集中在生物學(xué)過程中的代謝過程、細(xì)胞過程和單一生物過程。涉及差異基因下調(diào)數(shù)目較多的生物通路主要集中在代謝通路、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成。推測(cè)植物酸中含有的酸類、酚類等活性物質(zhì)可能是通過滲透的方式進(jìn)入煙曲霉細(xì)胞內(nèi)，干擾這些信號(hào)通路及相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制煙曲霉生長(zhǎng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)星形孢菌素生物合成通路中相關(guān)基因明顯下調(diào)，最終減少煙曲霉菌毒素的合成，這一結(jié)果解釋了加入植物酸液體培養(yǎng)煙曲霉菌時(shí)，色素量明顯下降的現(xiàn)象。

總之， 植物酸能抑制煙曲霉菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子囊的形成，在煙曲霉生長(zhǎng)過程中，植物酸通過干擾多個(gè)相關(guān)基因，致使多個(gè)信號(hào)通路受到影響，從而達(dá)到抑制煙曲霉菌的作用。植物酸的抑菌作用可能是乙酸、酚類和糠醛等多種成分共同作用的結(jié)果[15-17]，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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