腎衰康灌腸液通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)HK-2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究?

羅芯怡，葉乃菁，鄧榮榮，李明權(quán)

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610075)

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是常見(jiàn)的急危重癥，其死亡率高，缺乏有效的治療措施，臨床以對(duì)癥處理和腎臟替代治療為主，缺乏有效的治療藥物，嚴(yán)重威脅影響患者的生命安全和生存質(zhì)量。缺血性急性腎損傷是急性腎損傷的主要類型，占75%以上[1]。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)引起促生存信號(hào)通路和促凋亡信號(hào)通路調(diào)控失衡，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡，是缺血性急性腎損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制[2-4]。ERS蛋白如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子(CHOP)等表達(dá)增加，可提高ERS狀態(tài)下細(xì)胞處理未折疊蛋白或抵御其他細(xì)胞應(yīng)激的能力[5]。

腎衰康灌腸液是目前以急性腎損傷為適應(yīng)癥的惟一上市應(yīng)用的中成藥，具有確切的臨床療效，但腎衰康灌腸液在細(xì)胞層面對(duì)急性腎損傷的治療作用研究缺乏。為驗(yàn)證該藥的有效性，本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)缺氧再?gòu)?fù)氧模型模擬腎缺血再灌注損傷，以排除在體各因素的影響，觀察細(xì)胞凋亡情況及GRP78、CHOP表達(dá)的變化，探討腎衰康灌腸液是否有抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激治療缺血性急性腎損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭SPFWistar級(jí)大白兔6只，雌雄各半，體質(zhì)量 2.0～2.2 kg，購(gòu)自達(dá)碩公司[合格證號(hào)SCXK(川)2012-11]，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，保持室內(nèi)相對(duì)濕度(60±5)%，溫度20～22 ℃，室內(nèi)12 h明暗自動(dòng)切換，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

實(shí)驗(yàn)藥品：腎衰康灌腸液(大黃、黃芪、丹參、紅花組成)，20 ml×10支/盒，海南天元制藥廠提供(批號(hào)Z46020083)，常溫保存。對(duì)照灌腸液：PBS溶液，成都中醫(yī)藥大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室配置，保存于室溫中。

1.3 試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)試劑： CHOP、GRP78抗體均由Abcam公司提供，HK-2細(xì)胞、DMEN/F12由Gibco公司提供， CFSE及PI染液由Sigma公司提供，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由BD公司提供，活性氧檢測(cè)試劑由Invitrogen公司提供等。 實(shí)驗(yàn)儀器：正置、倒置熒光顯微鏡(BX51，OLYMPUS/日本)，流式儀(bio-rad)，離心機(jī)(ST16R，Thereto/美國(guó))，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD，蘇凈安泰)，高頻數(shù)控超聲波清洗器(KQ-200TDB，昆山市超聲儀器有限公司)，電泳系統(tǒng)(PowerPac Basic， Bio-rad/美國(guó))，恒溫震蕩箱(QYC-200型，上海福瑪)， RT-PCR儀(PIKORed96，美國(guó)ThermoFisher儀器有限公司)、冰柜(DW-40 W 100，海爾)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 含藥血清的制備及標(biāo)本采集 動(dòng)物飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，購(gòu)買后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常血清組、空白組、腎衰康灌腸液高劑量組3組各2只。

正常血清組給予正常喂養(yǎng)；腎衰康灌腸液高劑量組給予腎衰康灌腸液灌腸，藥量按人與動(dòng)物體表面積換算得出，高劑量為9.617 ml·kg-1[6-7]；空白組給予等量PBS溶液灌腸。腎衰康灌腸液高劑量組和空白組每天灌腸量分4次完成，于第4天上午灌腸1次后，3組兔子分別采血離心取上清、過(guò)濾除菌。

以腎衰康灌腸液高劑量組血清與正常血清組血清按比例混合，制備腎衰康灌腸液中劑量組血清(含高劑量組血清50%)和腎衰康灌腸液低劑量組血清(含高劑量組血清25%)。將空白組、腎衰康灌腸液高劑量組、腎衰康灌腸液中劑量組、腎衰康灌腸液低劑量組各組血清冷存。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理 人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2細(xì)胞)以含 10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，同步化24 h。

1.當(dāng)前在小學(xué)生英語(yǔ)的教學(xué)領(lǐng)域，有一大部分教師沿用傳統(tǒng)英語(yǔ)教學(xué)方法，不僅在方法上被時(shí)代所淘汰，在教學(xué)理念上也非常陳舊和落后，很多農(nóng)村的教師在新式的教學(xué)方法方面幾乎沒(méi)有涉及過(guò)信息化教學(xué)模式，在他們的教學(xué)過(guò)程中根本無(wú)法有效地在課堂上吸引學(xué)生的注意力。在這種情況下，學(xué)生學(xué)習(xí)積極性很難被充分調(diào)動(dòng)。

取2組細(xì)胞，空白組常規(guī)培養(yǎng)，不預(yù)缺氧/復(fù)氧處理，也不加含藥血清處理；模型組細(xì)胞密封處理，以模擬體內(nèi)細(xì)胞缺血再灌注損傷過(guò)程，然后檢測(cè)從造模開(kāi)始(0 h)0、1、2、3、4、5、6、7 h各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平，以推測(cè)細(xì)胞缺氧復(fù)氧的造模時(shí)間。

造模時(shí)間確定后，隨機(jī)分為正常培養(yǎng)組、缺氧/復(fù)氧組、低劑量組、中劑量組、高劑量組5組。正常培養(yǎng)組加入空白組兔血清(含PBS血清)，其余4組密封處理，待造模時(shí)間解除密封，以模擬體內(nèi)細(xì)胞缺血再灌注損傷狀態(tài)。缺氧/復(fù)氧組再加入空白組兔血清(含PBS血清)，腎衰康灌腸液各劑量組分別再加入其高、中、低劑量含藥血清。以上各組血清的體積分?jǐn)?shù)為 0. 1，孵育48 h，并分別于0、4、8、12、24和48 h檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.4.3 觀察指標(biāo)與方法 細(xì)胞ROS檢測(cè):測(cè)定細(xì)胞在造模結(jié)束并加入相應(yīng)血清后在加蓋并膠帶密封7 h后0、1、2、3、4、5、6、7 h細(xì)胞內(nèi)ROS水平，以推測(cè)細(xì)胞缺氧復(fù)氧的造模時(shí)間。操作方法：稀釋ROS原液，收集細(xì)胞加入一定量的ROS工作液。37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min后，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光；吸棄ROS染液，PBS清洗2次，加入Hoechst33345染液(250X，藍(lán)光)，37 ℃培養(yǎng)箱孵育5～10 min，PBS清洗觀察熒光。

細(xì)胞損傷/凋亡率檢測(cè):以CFSE/PI法、流式細(xì)胞分析聯(lián)合Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)5組細(xì)胞造模后分別加入空白組、對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組5組血清后0、4、8、12 h的細(xì)胞凋亡/死亡情況。操作方法：收集細(xì)胞，細(xì)胞懸浮液準(zhǔn)備，分別染色加入等體積CFSE、 FITC Annexin V和PI工作液，混合均勻于37 ℃孵育10 min，PBS清洗，于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)基因檢測(cè):采用RT-qPCR法檢測(cè)對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組4組血清造模后0、4、8、12 h時(shí)細(xì)胞內(nèi)ERS標(biāo)志分子GRP78、CHOP的mRNA。操作方法：將組織塊剪成小塊，加入定量的Trizol細(xì)胞裂解液，然后用超聲細(xì)胞粉碎儀處理，細(xì)胞裂解液變渾濁即可。對(duì)于細(xì)胞：用PBS溶液將細(xì)胞清洗1次，每孔加入400 μL trizol細(xì)胞裂解液，吹打使細(xì)胞完全裂解；分離，沉淀為RNA，洗滌、溶解RNA，RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA(引物序列：Actin：上游：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，GRP78:上游：5′-CATCACGCCGTCCTATGTCG-3′，下游：5′-CGTCAAAGACCGTGTTCTCG-3′，CHOP：上游：5′-GGAAACAGAGTGGTCATTCCC-3′，下游：5′-CTGCTTGAGCCGTTCATTCTC-3′)，37 ℃孵育40 min，終止反應(yīng)，85 ℃孵育5 min，cDNA產(chǎn)物稀釋20～50倍后使用，保存于-20 ℃，然后將PCR板置于RT-PCR儀上運(yùn)行。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)蛋白檢測(cè):半定量western用于檢測(cè)對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組4組血清造模后0、4、8、12 h時(shí)細(xì)胞內(nèi)ERS標(biāo)志分子GRP78、CHOP的蛋白表達(dá)情況。操作方法：收集蛋白樣品配制凝膠，上樣與電泳，按順序加入5 μL maker，5-10 μL樣品，5 μL loading buffer。加入電泳緩沖液，插好正負(fù)極，用90 V 跑完濃縮膠后，調(diào)節(jié)電壓至130 V跑分離膠，待樣品接近凝膠底端時(shí)關(guān)閉電壓；轉(zhuǎn)模封閉，將PVCF膜在甲醇中浸泡2 min，然后用轉(zhuǎn)膜液清洗1次(1000 ml轉(zhuǎn)膜工作液的配制：100 ml 10×的轉(zhuǎn)膜液+200 ml 的乙醇 +700 ml的二次水)， 4 ℃ 90 V跑1～1.5 h，BSA溶液37 ℃孵育0.5～1 h，不要清洗直接進(jìn)行一抗孵育。一抗用PBS-T(含0.1%的Tween 20的PBS溶液)按1∶1000稀釋，4 ℃過(guò)夜或室溫孵育1.5 h。然后PBS-T清洗3次，每次5 min。二抗孵育，用PBS-T(含1‰的Tween-20)按1∶1000稀釋，室溫或37 ℃孵育1 h，然后PBS-T清洗3次，每次5 min，最后顯影及定影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞ROS檢測(cè)

圖1～3顯示，正常組細(xì)胞內(nèi)未觀察到綠色熒光；隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，3 h時(shí)模型組(缺氧處理)出現(xiàn)綠色熒光，5 h時(shí)模型組ROS綠色熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)(箭頭提示處)，細(xì)胞內(nèi)活性氧達(dá)到最高值；5 h后細(xì)胞凋亡明顯，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故細(xì)胞缺氧復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)為密封5 h。

2.2 CFSE/PI染色實(shí)驗(yàn)

圖4～8顯示，造模0 h時(shí)的CFSE/PI染色結(jié)果表明，各組中紅色亮點(diǎn)沒(méi)有明顯增加，即細(xì)胞死亡率未出現(xiàn)明顯變化；4 h時(shí)各組細(xì)胞死亡率明顯增加，表明細(xì)胞模型成功；而在含藥血清處理造模細(xì)胞12 h時(shí)，藥物組細(xì)胞死亡率明顯低于對(duì)照組和PBS組，其中高劑量組最為明顯，表明該藥物的藥效具有濃度依賴性；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞死亡率逐漸回到正常水平，造模效果消失。

圖1 造模0 h時(shí)ROS檢測(cè)比較(×40)

圖2 造模3 h時(shí)ROS檢測(cè)比較(×40)

圖3 造模5 h時(shí)ROS檢測(cè)比較(×40)

圖4 含藥血清處理造模細(xì)胞0 h后CFSE/PI染色結(jié)果比較(×40)

圖5 含藥血清處理造模細(xì)胞4 h后CFSE/PI染色結(jié)果比較(×40)

CFSE/PI染色結(jié)果表明，該含藥血清對(duì)缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡/死亡有一定的抑制效果，高劑量組藥效最佳。CFSE/PI染色法表明，本次實(shí)驗(yàn)HK-2細(xì)胞缺血再灌注損傷模型建立成功。隨著造模后時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡逐漸增加直到24 h，各組凋亡率與空白對(duì)照組相當(dāng)，此時(shí)藥物作用失效。我們推測(cè)腎衰康灌腸液抑制細(xì)胞凋亡與藥物劑量有關(guān)。

2.3 流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡情況

圖6 含藥血清處理造模細(xì)胞12 h后CFSE/PI染色結(jié)果比較(×40)

圖7 含藥血清處理造模細(xì)胞24 h后CFSE/PI染色結(jié)果比較(×40)

注：*P<0.05，**P<0.01圖8 含藥血清對(duì)各組處理細(xì)胞0～24 h、CFSE/PI染色的影響

圖9、10顯示，為進(jìn)一步探索腎衰康灌腸液含藥血清對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷HK-2細(xì)胞的凋亡影響和量化相關(guān)指標(biāo)，我們采用Annexin V-FITC/PI聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)，定量分析各組細(xì)胞在造模后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡/死亡率。造模0 h時(shí)，各組細(xì)胞的凋亡/死亡率均未出現(xiàn)明顯變化；從0 h開(kāi)始到12 h，對(duì)照組和PBS組均能檢測(cè)到大量的細(xì)胞凋亡/死亡率；而在24 h后，細(xì)胞凋亡/死亡明顯恢復(fù)，造模效果喪失(48 h數(shù)據(jù)未展示)。在12 h，3個(gè)含藥血清組均有明顯的凋亡/死亡抑制效果。

上述結(jié)果顯示，在HK-2細(xì)胞中含藥血清對(duì)缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡/死亡具有明顯的抑制效果，且這一效果可以持續(xù)到缺血再灌注損傷影響消失。

2.4 RT-PCR實(shí)驗(yàn)

圖11、12顯示，在檢測(cè)基因及蛋白時(shí)，因正常組未缺氧/復(fù)氧造模檢測(cè)無(wú)意義，故檢測(cè)時(shí)未再檢測(cè)正常組相關(guān)指標(biāo)，對(duì)照組即可對(duì)照。含藥血清處理模型細(xì)胞4 h后，GRP78、CHOP基因表達(dá)均下降發(fā)生明顯變化；從4 h到12 h GRP78升高表達(dá)，逐漸恢復(fù)至正常水平。相對(duì)于PBS組，低、中、高劑量組對(duì)HK-2細(xì)胞中GRP78、CHOP的基因表達(dá)(P<0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果顯示，含藥血清抑制缺血再灌注損傷模型HK-2細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

2.5 WB實(shí)驗(yàn)

圖13顯示，GRP78和 CHOP蛋白表達(dá)在空白組及實(shí)驗(yàn)組，無(wú)論高、中、低劑量改變不明顯，說(shuō)明腎衰康灌腸液改變蛋白變化不明顯，對(duì)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中GRP78、CHOP蛋白表達(dá)不明確。其中CHOP條帶下出現(xiàn)非特異性條帶，可能是蛋白降解后產(chǎn)生的小片段堆積在膠底導(dǎo)致，對(duì)最后結(jié)果無(wú)明顯影響。

圖9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡/死亡率

注：*P<0.05圖10 不同時(shí)間點(diǎn)各組處理的細(xì)胞凋亡/死亡率比較

注：*P<0.05圖11 相對(duì)于PBS組，低、中、高劑量組對(duì)HK-2細(xì)胞中GRP78的基因表達(dá)

注：*P<0.05圖12 相對(duì)于PBS組，低、中、高劑量組對(duì)HK-2細(xì)胞中CHOP的基因表達(dá)

注：條帶分子量β-actin：45 kDa；CHOP：27 kDa；GRP78:78 kDa圖13 CHOP、GRP78蛋白表達(dá)比較

3 討論

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是常見(jiàn)的急危重癥，其死亡率高[8]，目前尚無(wú)有效的治療藥物，嚴(yán)重威脅患者的生命安全和生存質(zhì)量。成都中醫(yī)藥大學(xué)研制的腎衰康灌腸液遵循中醫(yī)“清熱解毒”“活血化瘀”“益氣利尿”治則，由大黃、黃芪、丹參、紅花組成。方中大黃通下能使病邪有出路，使堆聚在人體的水分和廢物能從腸道排出，有助于病人渡過(guò)少尿、無(wú)尿的危急階段[9]。同時(shí)大黃改善代謝作用顯著，現(xiàn)代中藥藥理研究學(xué)表明，大黃有利尿和改善腎功能的作用，可以減少腸道對(duì)氨基氮的吸收，利用氨合成蛋白質(zhì)，抑制體蛋白分解，促進(jìn)尿素和肌酐隨尿液排出體外[10-12]。黃芪能扶正固本、利尿消腫，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、雙向調(diào)節(jié)血壓、降低蛋白尿、擴(kuò)張外周血管及增強(qiáng)非特異性免疫作用[12]。其主要成分之一黃芪甲苷，能明顯減少缺血再灌注時(shí)GRP78的表達(dá)，通過(guò)抑制ERS保護(hù)大鼠缺血/再灌注器官[13]；紅花、丹參具有活血化瘀的功效，可以擴(kuò)張血管，解除微血管痙攣，特別是腎小動(dòng)脈痙攣，防止血細(xì)胞聚集，改善微循環(huán)，使腎血流量恢復(fù)[14-15]，抑制人腎成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)機(jī)體代謝，達(dá)到改善腎間質(zhì)纖維化的作用[15]。本藥臨床治療急性腎損傷有效率一直在80%以上[16]。

本實(shí)驗(yàn)因條件有限無(wú)三氣培養(yǎng)箱，故采用檢測(cè)ROS，以推測(cè)細(xì)胞在缺氧條件下的活性情況，同時(shí)證明造模成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腎衰康灌腸液對(duì)體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2細(xì)胞)缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡/死亡有明顯改善，驗(yàn)證了腎衰康灌腸液不僅臨床治療急性腎損傷有效，從細(xì)胞學(xué)角度證明對(duì)缺血性急性腎損傷也有治療作用。

缺血性AKI是主要類型[1]，其主要特征是腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。研究表明[2-4]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起促生存信號(hào)通路和促凋亡信號(hào)通路調(diào)控失衡，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡，是缺血性急性腎損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。

細(xì)胞在多種理化因素(缺氧、饑餓、鈣離子平衡失調(diào)、化學(xué)毒物等)的刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊及未折疊蛋白質(zhì)的聚集，這種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)在功能紊亂的狀態(tài)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[17]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為適應(yīng)正在改變的環(huán)境或重新建立一個(gè)正常的ER功能，將逐漸形成一種稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)的信號(hào)通路[18]。UPR由3種ER感應(yīng)蛋白介導(dǎo)，分別是PERK、ATF6和IRE-l，在未發(fā)生應(yīng)激時(shí)都以無(wú)活性狀態(tài)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78結(jié)合。錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白的積聚使GRP78從3種感應(yīng)蛋白上解離，轉(zhuǎn)而去結(jié)合錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白。解離后的感應(yīng)蛋白被活化并啟動(dòng)UPR，包括早期蛋白質(zhì)合成的廣泛抑制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶和折疊酶的轉(zhuǎn)錄激活等一系列反應(yīng)，從而降低錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的積累，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，是一個(gè)促生存信號(hào)途徑，故GRP78表達(dá)的上調(diào)是ERS的標(biāo)志，在應(yīng)激條件下對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用[19]。

PERK、ATF6以及IRE-l信號(hào)不僅能夠啟動(dòng)ERS的生存途徑，當(dāng)過(guò)強(qiáng)或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的ERS導(dǎo)致ER功能受損時(shí)，這3條信號(hào)通路同樣能夠啟動(dòng)由ERS所介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，去除受損傷的細(xì)胞。ERS引起的細(xì)胞凋亡有一套自身的信號(hào)傳遞通路，稱之為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡(ER-ssociated death，ERAD)途徑[20]。目前發(fā)現(xiàn)，ERAD相關(guān)途徑有3條，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子(CHOP)、天冬氨酸特異性半肌氨酸蛋白-12(Caspase-12)和c-Ju氨基末端激酶(JNK)[21-23]。故臨床研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)CHOP、Caspase-12、JNK 3條通路研究。其中CHOP在真核動(dòng)物的組織細(xì)胞中廣泛存在，其編碼蛋白與多種細(xì)胞功能活動(dòng)(如增殖、分化、凋亡)密切相關(guān)。據(jù)研究報(bào)道，CHOP基因可通過(guò)抑制Bcl-2(凋亡負(fù)調(diào)節(jié)蛋白)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，也可通過(guò)與促凋亡死亡受體5(DR5)基因5'翼狀區(qū)結(jié)合而增加后者蛋白的表達(dá)，而后者是激活caspase家族的重要分子[24-25]。在CHOP基因過(guò)表達(dá)以及運(yùn)用CHOP敲除小鼠的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，CHOP蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及凋亡[26-27]。正常情況下，CHOP幾乎不表達(dá)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)可通過(guò)IRE-1、 PERK和ATF6的活化促進(jìn)CHOP的大量表達(dá)，最終引起細(xì)胞凋亡。

最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛嬖趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的激活，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路參與引起細(xì)胞凋亡(GRP78，CHOP基因表達(dá)在不同組別有明顯不同)，腎衰康灌腸液可減少HK-2細(xì)胞凋亡率，減輕腎缺血再灌注損傷。但是檢測(cè)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中的GRP78、CHOP蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，推測(cè)腎衰康灌腸液減輕腎缺血再灌注損傷的機(jī)制可能不是通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中的GRP78、CHOP起作用，可能檢測(cè)蛋白應(yīng)考慮從IRE-1、 PERK和ATF6檢測(cè)，或腎衰康灌腸液治療是通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中其他信號(hào)通路起作用的，有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明中藥腎衰康灌腸液確實(shí)有抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激治療HK-2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用。該中藥不僅臨床有效，且驗(yàn)證了中藥復(fù)方在細(xì)胞層面治療急性腎損傷的有效性，為急性腎損傷的中醫(yī)治療提供了新的理論依據(jù)。