小鼠經腰段鞘內置管的建立方法

徐靜，孫彩霞，張進，陸培春，蔣錦，蘇兆亮

（1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學附屬醫(yī)院 麻醉科，江蘇 鎮(zhèn)江212001；3.江蘇大學醫(yī)學院 免疫學研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

鞘內置管術對脊髓水平的藥理和生理機制研究必不可少，特別是在疼痛學研究中[1-2]，可以確保低劑量藥物在蛛網膜下腔長期慢性作用于脊髓，無需考慮藥物血腦屏障的滲透性和對其他臟器的毒性作用[3-5]。2004年WU等[6]介紹經小鼠腰段蛛網膜下腔長期置管的方法，2010年翁曲瑩等[7]在此基礎上進一步改善、簡化置管方法，但仍存在成功率低、損傷大等缺點。本研究發(fā)現(xiàn)使用硬膜外導管和改良后的穿刺引導針能明顯改善上述情況，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及材料

60只昆明雄性小鼠，6～8周齡，由江蘇大學動物實驗中心提供，按隨機數(shù)字表法分為改良組和Wu方法組，每組30只。VonFrey纖維絲（美國Stolting公司），25 μl微量注射器（鹽城市城南新區(qū)科盾辦公用品經營部），顯微手術器械（江蘇大學附屬醫(yī)院），電熱恒溫水槽（上海精密儀器儀表公司），硬膜外導管、穿刺針（無錫市通達醫(yī)療電器有限公司），針灸針（北京珞亞山川醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 穿刺引導針制備改良組 ：使用的針灸針前端針身（直徑0.16 mm，長4.0 cm）與腰麻針（直徑0.23 mm，長10 cm）相接（激光焊接），制成總長約14 cm的改良穿刺針。Wu方法組：采用直徑約0.12 mm的鎢絲。見圖1。

圖1 穿刺引導針示意圖

1.2.2 導管制備取外徑 1.0 mm 的硬膜外導管 4 cm，均勻拉長至8 cm，外徑約0.7 mm導管，再將前端2 cm在熱水浴中均勻拉長至4 cm，總長為10 cm，前端長4 cm，外徑約 0.3 mm，后端長6 cm，外徑約0.7 mm，用微量注射器定容死腔容積約5 μl左右，多余部分從粗端剪去。改良組：采用翁法[7]以Parafilm膜剪成細長段纏繞導管，繞成3個小球以固定和定位，第1個小球距離導管細端約1.8～2.0 cm，在距離導管粗端約2.5～3.0 cm處纏繞第2個小球，距第2個小球0.3～0.5 cm最靠近導管粗端處纏繞第3個小球。Wu方法組：為避免管腔塌陷先將直徑0.12 mm的鎢絲穿入改良后的導管，分別在距導管粗端2.5 cm和導管細端2.0 cm處通過火焰迅速加熱輕壓以形成兩個直徑約1.5 mm的小球，用于固定和定位，最后抽出鎢絲備用。

1.2.3 麻醉及手術方法改良組 ：小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉75 mg/kg，麻醉后取俯臥位固定四肢，兩側髂棘連線與脊柱交界點定位L6棘突，以L5～L6為手術中心，沿脊柱做1個約1 cm的縱行切口，用1 ml注射器針頭（外徑0.45 mm）穿破椎體表面肌肉，進針約2 mm即可拔出針頭，將改良的穿刺引導針插入已制備好的導管，引導針前端露出約1 mm針身，使針身與脊柱成20～30°角度向頭側進針，進針深度約4 mm左右，當小鼠出現(xiàn)一過性甩尾或后肢抽動表示已穿破硬脊膜，將引導針后退約1～2 mm以免損傷脊髓，將導管在穿刺針的引導下繼續(xù)緩慢向蛛網膜下腔頭端置管至導管上第一個小球處，在小球上下用5-0慕絲線分別于椎旁肌肉結扎固定，縫合切口。在頸部做第2個切口，鈍性分離皮下組織以形成兩切口之間縱行通道，導管粗端通過此通道送出頸部切口，與固定第1個小球的方法相同，在皮下肌肉固定第2個小球，皮外固定第3個小球，最后縫合頸部皮膚切口時再次纏繞小球上下2次固定。熱凝封閉導管。Wu方法組：用相同方法麻醉固定小鼠，以脊柱L5～L6間隙為中心做1個約2 cm的縱行切口，左手抓緊骨盆髂棘處以固定及定位，右手使用23 G針頭刺破椎體表面的肌肉，內置鎢絲的導管以與脊柱成20～30°的方向沿著針頭走形形成的通道置入，如突然出現(xiàn)甩尾或后肢抽動等穿破硬脊膜的特征，即將內置的導絲向后退2 cm以防止鎢絲損傷脊髓，導管向前置到約腰膨大的位置后，將第1個小球與淺層肌肉縫合固定。在頸部做第2個切口，導管粗端通過兩切口之間鈍性分離出來的通道送出頸部切口，在切口處皮下肌肉固定第2個小球。縫合切口，熱凝封住導管末端。

1.3 觀察指標

1.3.1 導管泄漏率術前在導管粗端連接微量注射器，推注生理鹽水，如觀察到除導管細端出口之外的地方有液體滲漏，則表明存在導管泄漏，分別統(tǒng)計兩組導管泄漏的數(shù)量，剔除泄漏的導管。

1.3.2 癱瘓率與死亡率置管后第 1 天，分別統(tǒng)計兩組小鼠術后單側或雙側癱瘓和死亡只數(shù)，計算癱瘓率和死亡率。挑選出陰性的小鼠用于后續(xù)實驗。

1.3.3 置管成功率使用微量注射器依次抽取生理鹽水 5 μl，空氣 1 μl，2% 利多卡因 5 μl，計 11 μl全部通過導管注入，以使5 μl的藥物能全部推入鞘內。若給藥后10～15 s內小鼠出現(xiàn)持續(xù)10～12 min的下肢癱瘓即為置管成功。計算兩組小鼠置管成功的只數(shù)，計算成功率。選擇成功的小鼠用于后續(xù)實驗。

1.4 熱甩尾潛伏期

在置管前至置管后7 d，每天分別將兩組小鼠尾端1/3置入48℃恒溫熱水浴中，記錄小鼠出現(xiàn)甩動尾巴或縮出水面的時間，浸于水中時間最大不超過15 s以防止燙傷。每只小鼠測3次取其平均值，每次間隔時間為10 min，記錄小鼠的熱甩尾潛伏期（the tailflick latency,TFL）。

1.5 50%機械縮足反應閾值

在置管前至置管后7 d，在安靜環(huán)境下，采用Up and Down法[8]將VonFrey纖毛垂直刺激小鼠足底皮膚，每次刺激間隔至少30 s，纖毛最大折力為2.0 g，超過此值時記為2.0 g，根據(jù)刺激的纖毛力度及小鼠的縮足反射推算50%機械縮足反應閾值（mechanical withdrawal threshold,MWT）。

1.6 脊髓形態(tài)和導管位置

在結束所有行為學檢查之后，將1% 亞甲藍5 μl注入導管后處死小鼠，切開腰段皮膚觀察導管所在位置有無滑脫，統(tǒng)計各組的導管滑脫率，分離取腰段脊髓，在顯微鏡下觀察脊髓形態(tài)和導管位置。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，多時間點的比較采用重復測量設計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 置管后兩組觀察指標的比較

改良組與Wu方法組比較，導管泄漏率和術后癱瘓率減少（P＜0.05），死亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。改良組置管成功率與Wu方法組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），改良組增加。兩組小鼠顯微鏡下脊髓形態(tài)無差異，改良組導管滑脫率與Wu方法組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），改良組下降。見表1。

2.2 TFL比較

改良組與Wu方法組小鼠在置管前至置管后7d內各時間點TFL值的比較采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的TFL值無差異（F=2.741，P=0.103）；②兩組的 TFL值無差異（F=7.165，P=0.055）；③兩組的TFL值隨時間變化趨勢無差異（F=0.258，P=0.826）。見圖2 和表2。

表1 置管后兩組觀察指標的比較 （n =30，%）

2.3 50% MWT比較

圖2 小鼠置管前至置管后7 d甩尾反應變化趨勢（n =30，±s）

表2 兩組各時間點的 TFL 比較 （n =30，±s）

表2 兩組各時間點的 TFL 比較 （n =30，±s）

組別 置管前 置管后第1天 置管后第2天 置管后第3天 置管后第4天 置管后第5天 置管后第6天 置管后第7天改良組 4.74±0.02 4.77±0.04 4.78±0.04 4.82±0.05 4.80±0.03 4.78±0.03 4.77±0.03 4.79±0.01 Wu 方法組 4.75±0.02 4.79±0.04 4.82±0.03 4.83±0.03 4.82±0.03 4.81±0.03 4.80±0.05 4.82±0.04

改良組與Wu方法組小鼠在置管前至置管后7d內各時間點50% MWT比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的50% MWT值無差異（F=1.506，P=0.206）。②兩組的 50% MWT 值無差異（F=5.449，P=0.080）。③兩組的 50% MWT 值隨時間變化趨勢無差異（F=0.114，P=0.997）。見表3 和圖3。

表3 兩組各時間點的 50% MWT 比較 （n =30，±s）

表3 兩組各時間點的 50% MWT 比較 （n =30，±s）

組別 置管前 置管后第1天 置管后第2天 置管后第3天 置管后第4天 置管后第5天 置管后第6天 置管后第7天改良組 1.50±0.03 1.48±0.02 1.48±0.03 1.47±0.02 1.48±0.03 1.49±0.02 1.50±0.02 1.51±0.02 Wu 方法組 1.51±0.02 1.50±0.02 1.50±0.01 1.49±0.03 1.49±0.02 1.50±0.03 1.51±0.03 1.52±0.03

圖3 小鼠置管前至置管后7 d 50% MWT變化趨勢（n =30，±s）

3 討論

鞘內置管技術為動物實驗長期鞘內給藥和采集腦脊液提供極大的便利。目前鞘內給藥方式有蛛網膜下腔穿刺和鞘內置管兩種，蛛網膜下腔穿刺有便利快捷、簡便易行等優(yōu)點[9-10]，但其有明顯的局限性：①穿刺過程中可出現(xiàn)脊髓、神經損傷，不適用于反復持續(xù)給藥觀察的研究。②無法僅憑手感判斷注射成功。③給藥過程需要制動老鼠導致急性應激反應，干擾實驗結果[11-12]。而鞘內置管可以長期給藥，且保證藥物注射至鞘內，但眾多模型表示置管仍有操作復雜、置管失敗、腦脊液漏、脊髓損傷、導管脫落等并發(fā)癥[13]，因此探討簡單、安全、方便的鞘內置管技術至關重要。

本研究過程中發(fā)現(xiàn)Wu法存在以下幾點不足：①PE10導管拉伸性欠佳，極易容易拉斷，影響后續(xù)操作；②PE導管采用火焰快速加熱后壓迫形成固定定位用的小球，卻容易在此過程中損傷導管造成泄漏，另由于小球過小，固定處容易滑脫進而造成導管滑脫移位；③鎢絲細軟，使用鎢絲作為內置導絲，在穿過脊柱周圍組織時受壓而變形彎曲，另難以穿破堅韌的椎間韌帶和硬脊膜，置入受阻以致置管失敗。針對上述情況，本研究作了相對的改善：①導管使用硬膜外導管，雖初始直徑較PE10粗，但其拉伸延展性極好，能達到實驗所需直徑，且不易拉斷。②導管采用Parafilm封口膜纏繞可固定成所需體積的小球，且在頸部切口處有兩個小球，分別與切口內外肌肉縫合固定，即可防止導管被小鼠拔除，又可防止導管回縮至皮下。③采用中醫(yī)針灸針直徑0.16 mm，因其只有4 cm長，故后端與直徑0.23 mm的腰麻針連接，前端有針尖，能同時保證導絲的硬度和前端尖銳，極大程度地減少穿破椎間韌帶和硬脊膜的阻力，同時減少導絲彎曲變形的概率。但需注意出現(xiàn)穿破硬脊膜的征象后要立即后退導絲，防止損傷脊髓。

研究中改良組仍有較低的術后癱瘓率及死亡率，可能在刺破硬膜后沒有及時撤回穿刺導絲而損傷到脊髓有關，在操作熟練后能進一步避免。另本研究最主要的改良點在于使用硬膜外導管、針灸針、腰椎穿刺針，這些材料易得，實驗結果表明采用改良的導管及導管固定方法可以明顯降低導管泄漏率、導管滑脫率，而改裝的穿引導絲前端的針尖能減少穿刺阻力，增加導絲韌度。改良組較Wu方法組可明顯提高置管成功率，降低術后并發(fā)癥。綜上所述，建立鞘內置管模型的方法是行之有效的。