回陽固元方對人乳頭瘤病毒感染細(xì)胞凋亡的影響研究*

曹萍，朱偉，楊同華

（1.云南省第一人民醫(yī)院 皮膚科，云南 昆明 650032；2.昆明理工大學(xué)，云南 昆明 650504）

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus,HPV）是一種小分子DNA病毒，容易吸附在人體皮膚及黏膜誘發(fā)疾病。尖銳濕疣（condyloma acuminatum,CA）是由HPV感染引起的生殖器皮膚增生性疾病，也是性傳播疾病的一種，其發(fā)病率在我國性傳播疾病中位居前列，在性接觸較高的歐美國家，其發(fā)病率更高。因此，CA受到全球?qū)W者的廣泛關(guān)注[1-2]。

回陽固元方由回陽飲演化而來，回陽飲為清代四川名醫(yī)鄭欽安治療下元虧損而設(shè)，以此為基礎(chǔ)，云南省已故著名溫陽大家吳附子吳佩衡先生創(chuàng)制大回陽飲[3]，臨床上對多種中西醫(yī)難治的疾病療效頗佳。該方含附子、干姜，附子為第一溫陽藥，國內(nèi)知名的溫陽大家吳附子吳榮祖先生繼續(xù)發(fā)展為回陽固元方，對包括CA在內(nèi)的難治性疾病的療效有很大提高。本研究用不同濃度的回陽固元方，探討該方的扶正作用對HPV感染細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

標(biāo)本皮膚組織取自云南省第一人民醫(yī)院皮膚科CA患者局部切除的皮損（HPV感染組）。正常組皮膚組織為本院泌尿外科正常人包皮切除組織。器材一次性塑料培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板及塑料凍存管2 ml（美國Corning公司），常規(guī)手術(shù)器械（淮安市醫(yī)療用品廠），0.22 μm微孔濾器（美國Millipore公司），熒光定量PCR儀 CFX96（美國BIO-RAD公司），超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)州安泰空氣技術(shù)有限公司），5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Heraeus公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），酶標(biāo)儀（奧地利Clini Bio公司），直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶和96孔培養(yǎng)板（美國Falcon公司）；流式細(xì)胞儀FACS Calibur（美國 Becton Dicknson 公司）。

胰酶、PBS、青鏈霉素（以色列BI公司），熒光定量PCR試劑盒：CWBIO CW09570，RNase（美國Sigma公司），胰酶抑制劑、限制性角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（美國Gibco公司），DispaseⅡ（瑞士ROCHE公司）。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine,DAB）、蘇木精、細(xì)胞角蛋白（廣譜）CK（Pan）、鼠抗人單克隆抗體及二抗生物素標(biāo)記的兔抗鼠IgG（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。Caco-2細(xì)胞購置于中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 CA 患者皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞的分離與培養(yǎng)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定、細(xì)胞周期的檢測參照文獻(xiàn)[4]。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡對于貼壁細(xì)胞，可將細(xì)胞直接接種于蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。將回陽固元方不同藥物濃度作用后的角質(zhì)形成細(xì)胞采用細(xì)胞爬片的形式生長于蓋玻片，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對照組；取出蓋玻片然后用PBS沖洗細(xì)胞2次，沖洗過程中不宜過于激烈以免沖走細(xì)胞；在500 μl緩沖液中加入5 μl磷脂結(jié)合蛋白（Annexin V-FITC），5 μl碘化丙啶（propidium lodide,PI）混勻 ；將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使蓋玻片表面均勻覆蓋、避光，室溫反應(yīng)5 min。將蓋玻片倒置于載玻片，于熒光顯微鏡下、雙色濾光片（FITC和羅丹明）觀察。Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。檢測的細(xì)胞凋亡結(jié)果中，UL區(qū)為壞死細(xì)胞區(qū)，LL區(qū)為細(xì)胞存活區(qū)，LR區(qū)為早期凋亡區(qū)，UR區(qū)為晚期凋亡區(qū)，細(xì)胞凋亡率=（LR+UR）/LL，以此統(tǒng)計(jì)不同濃度、時間段的細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞Caco-2 模型的建立 將Caco-2細(xì)胞接種于轉(zhuǎn)運(yùn)池（Transwell）中的微孔濾膜上可形成單層細(xì)胞層，是用來模擬小腸上皮細(xì)胞層的吸收模型，該濾膜可由硝酸纖維素或者多聚碳酸酯制成。由于多聚碳酸酯膜不會形成藥物擴(kuò)散過程中的屏障，所以常選用多聚碳酸酯膜作為細(xì)胞單層模型的支架。取出冷凍的Caco-2細(xì)胞于37℃水浴鍋中快速融化，用吸管吹打成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入15 ml離心管中，加入含10%胎牛血清的新鮮DMEM（高糖）培養(yǎng)基，混勻后 1 200 r/min離心5 min，棄上清液，再加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，充分吹打成單細(xì)胞懸液，再混勻后1 000 r/min離心 5 min，棄上清液，加入適量含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基重懸，吹打，調(diào)整細(xì)胞密度在2×105～5×105個/L左右，然后接種于 TranswellTM細(xì)胞培養(yǎng)皿中（2 ml/孔），共6孔，在培養(yǎng)皿的下腔加入1 ml的DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、5% CO2濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天取出細(xì)胞，顯微鏡觀察細(xì)胞的生長貼壁情況，棄出舊培養(yǎng)基，并加入新鮮培養(yǎng)基，然后拍照記錄，以后培養(yǎng)過程中每隔1天更換1次培養(yǎng)基，并持續(xù)觀察細(xì)胞生長狀。結(jié)果表明，Caco-2細(xì)胞約在接種后1周長至培養(yǎng)皿的70%～80%，再持續(xù)培養(yǎng)才可以長滿至整個培養(yǎng)皿。通過對Caco-2細(xì)胞長滿后每個孔的觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞融合成完整的細(xì)胞層，細(xì)胞間連接緊密；該細(xì)胞形態(tài)與小腸上皮細(xì)胞極為相似，從形態(tài)學(xué)上可以確定所培養(yǎng)細(xì)胞為Caco-2細(xì)胞，細(xì)胞單層膜完整性較好，可用于藥物吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 回陽固元方的制備回流提取法在應(yīng)用乙醇等易揮發(fā)的有機(jī)溶劑作為溶媒提取中藥中有效成分時，為減少溶媒的使用量和溶媒的消耗，而采用加熱提取，是使溶媒揮發(fā)冷卻后重新回流至鍋內(nèi)的一種方法。秤取制附子 20g，干姜 15g，肉桂 10g，炙甘草 15g，麻黃10g，細(xì)辛3g，將秤取好的中藥材加工成細(xì)段或者粗粉放入多功能提取罐中，加入5倍量蒸餾水浸泡30min，用夾層蒸汽加熱，并及時打開冷凝器的冷卻水，沸騰時要先排除罐內(nèi)空氣，否則會使鍋內(nèi)帶壓，再關(guān)閉排氣閥。60min后收集濾液，將濾液回流抽提30min，過濾，加入3倍量的蒸餾水回流抽提30min，過濾，低溫低壓濃縮成 1g/ml的提取液共 50ml，經(jīng) 3500 r/min 離心5min，離心 3 次，再以 13000 r/min 離心 5min，離心3次，最后用0.45μm濾膜過濾，4℃密封無菌保存，使用前再用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。經(jīng)回流抽提得到回陽固元方的濃縮液，低溫低壓再濃縮成1g/ml的提取液，稀釋成5個濃度梯度，分別是5、10、20、40及80μg/ml。作用于目標(biāo)細(xì)胞時分5個時間段，分別是12、24、48、72及96h，然后測得不同中藥濃度和不同時間段的細(xì)胞指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)（ANOVA）分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CA皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞

正常組皮膚組織獲得的單細(xì)胞懸液，在光學(xué)顯微鏡下可見細(xì)胞呈典型的上皮樣特征，呈鋪路石狀，細(xì)胞核較大，且可見含有多個細(xì)胞核的細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有較多顆粒，細(xì)胞排列緊密折光性較好。CA皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)制成的單細(xì)胞懸液，細(xì)胞形態(tài)無鋪路石狀，細(xì)胞近似圓形，可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)。見圖1、2。

2.2 Caco-2細(xì)胞

Caco-2細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則狀，細(xì)胞排列緊密，具有微絨毛結(jié)構(gòu)，類似于小腸上皮細(xì)胞。Transwell（轉(zhuǎn)運(yùn)池）建立，Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于多聚碳酸酯膜上，排列緊密后使藥物透過Caco-2細(xì)胞層作用于目標(biāo)細(xì)胞或者收集透過后的濾液無菌保存，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。見圖3、4。

2.3 細(xì)胞凋亡

經(jīng)HPV感染的角質(zhì)形成細(xì)胞其凋亡率有所降低。見圖5、6。

圖1 正常角質(zhì)形成細(xì)胞 （×200）

圖2 CA 皮損角質(zhì)形成細(xì)胞 （×200）

圖3 Caco-2 細(xì)胞 （×200）

圖4 Transwell （轉(zhuǎn)運(yùn)池）

固定48h后，不同藥物濃度HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=159.932，P=0.000），隨著中藥濃度的增加，凋亡率逐漸增加；固定藥物濃度20μg/ml后，不同作用時間HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=140.794，P=0.000），隨著時間的增加，角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率逐漸增加。見表1、2。

圖5 正常角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡

圖6 感染角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡

表1 48 h不同藥物濃度HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率

表2 20 μg/ml不同作用時間HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率

3 討論

角質(zhì)形成細(xì)胞受損可引起多種疾病，而CA是其中較嚴(yán)重的一種，目前其根除性治療仍是臨床中的一大難題[5]。在CA的發(fā)病過程中，角質(zhì)形成細(xì)胞出現(xiàn)諸多變化，如何調(diào)整角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞周期是解決CA治療的關(guān)鍵所在[6]。1975年RHEINWALD和GREEN[7]首次在體外成功培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞，該里程碑式的成就為人類修復(fù)皮膚缺損奠定基礎(chǔ)。1981年O'CONNOR培養(yǎng)適于移植的人自體表皮細(xì)胞膜片[8]，為體外構(gòu)建組織工程皮膚及臨床應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是關(guān)于角質(zhì)形成細(xì)胞周期的研究甚少，如何闡述細(xì)胞周期與CA的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，是未來研究CA治療的趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，CA皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞在培養(yǎng)過程中易受白假絲酵母菌的污染，連續(xù)傳代及反復(fù)凍融都會破壞其細(xì)胞固有的生物學(xué)特性[9]。在檢測CA發(fā)病前后角質(zhì)形成細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖能力發(fā)現(xiàn)，感染HPV后的角質(zhì)形成細(xì)胞其周期縮短，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，使感染者快速出現(xiàn)皮損。臨床中常用直接去除疣體的辦法來治療CA，但治標(biāo)不治本，CA仍有較高的復(fù)發(fā)率。宿主局部免疫抑制和對HPV蛋白的異常識別導(dǎo)致的病毒免疫逃逸和持續(xù)感染是HPV感染相關(guān)疾病難以根治的主要原因[10]。

關(guān)于CA的中醫(yī)治療，國內(nèi)外研究得不多[11]，而且?guī)缀跏且郧鍩岢凉耢钚盀橹?，扶正固本者較少，中醫(yī)抗HPV感染的治療應(yīng)抓住主流本質(zhì)。本課題用極富云南特色的回陽固元方來誘導(dǎo)馴化HPV感染的角質(zhì)形成細(xì)胞，利用人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞Caco-2模型模擬人體小腸上皮細(xì)胞[12]，類似人體內(nèi)環(huán)境，更接近于中藥的體內(nèi)吸收過程。通過測定中藥作用后CA皮損角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率發(fā)現(xiàn)，隨著作用時間和中藥濃度的增加，角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率呈逐漸增加的趨勢，說明回陽固元方的扶正作用可誘導(dǎo)馴化患者皮損處的角質(zhì)形成細(xì)胞，促使其細(xì)胞凋亡。

CA的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，深入研究其發(fā)病機(jī)制對與皮損角質(zhì)形成細(xì)胞有關(guān)的皮膚病有著重要的理論和實(shí)踐意義，提示可以從細(xì)胞凋亡的途徑來治療相關(guān)的皮膚病，為其治療開辟新的領(lǐng)域。