董慶霖，王 瑤，邢向英，崔江坤，王雪晴

(河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130)

雨生紅球藻是一種高附加值的單細(xì)胞綠藻，在脅迫狀態(tài)下能夠大量合成蝦青素和油脂[1]。雨生紅球藻油脂的脂肪酸組成主要為棕櫚酸、油酸和亞麻酸等，可作為生物柴油的理想原料[2-3]。為提高雨生紅球藻用于生物柴油生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性和可持續(xù)性[4]，通常采用油脂和蝦青素聯(lián)產(chǎn)工藝[5-6]，但此工藝需要在脅迫條件下誘導(dǎo)油脂和蝦青素合成，降低了雨生紅球藻的生長速率，故油脂平均比合成速率依然較低。因此，如何同時提高生物量和油脂的平均合成速率，是雨生紅球藻用于生產(chǎn)生物柴油過程中所必須解決的關(guān)鍵問題。

自然界中微藻通常與其他微生物共生，兩者間的相互作用可影響藻細(xì)胞的生長及組成[7]，許多微生物對微藻生長和油脂積累具有促進(jìn)[8-15]或抑制作用[16-17]。目前，微藻-真菌混合培養(yǎng)的研究大多集中于絲狀真菌促進(jìn)藻細(xì)胞沉降從而降低采收成本[18]，而絲狀真菌對微藻生長和油脂合成的研究相對較少。

淡紫擬青霉TD16(以下簡稱TD16)是從藍(lán)藻培養(yǎng)液中分離的一種絲狀真菌[19]，TD16可促進(jìn)植物種子萌發(fā)以及葉片根系生長[20]。由于微藻和植物都是光合生物，因此本實驗將雨生紅球藻與TD16混合培養(yǎng)以研究TD16對雨生紅球藻細(xì)胞生長和油脂合成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藻種及培養(yǎng)基

雨生紅球藻，購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所，于BBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；淡紫擬青霉TD16，由本實驗室分離并保存于中國科學(xué)院微生物研究所菌物標(biāo)本館，于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

BBM液體培養(yǎng)基：硝酸鈉250 mg/L，磷酸二氫鉀175 mg/L，硫酸鎂75 mg/L，磷酸氫二鉀75 mg/L，乙二胺四乙酸二鈉50 mg/L，氫氧化鉀31 mg/L，氯化鈉25 mg/L，氯化鈣25 mg/L，硼酸11.4 mg/L，硫酸鋅8.82 mg/L，硫酸鐵4.98 mg/L，鉬酸鈉1.79 mg/L，硫酸銅1.57 mg/L，硝酸鈷0.49 mg/L。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，無水葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LG16-B臺式高速離心機(jī)，723N可見分光光度計，GXZ-300D光照培養(yǎng)箱，X-521無菌工作臺，TDA-8002恒溫水浴鍋，DH-101-0S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)，HZQ-QG全溫振蕩器，XSZ-H光學(xué)顯微鏡，YX280加壓滅菌鍋，LRH-150S恒溫恒濕培養(yǎng)箱，Multi N/C 3100有機(jī)碳分析儀，JP-020超聲波清洗機(jī)。

1.2 實驗方法

1.2.1 無菌雨生紅球藻藻種的制備

將納他霉素、慶大霉素按10 mg/L和100 mg/L加至雨生紅球藻培養(yǎng)液中，于25℃、光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s)下靜置培養(yǎng)14 d。將培養(yǎng)結(jié)束后的藻液稀釋105個/mL，取100 μL涂布至BBM平板上，重復(fù)多次得到無菌藻落，將無菌藻落接種至BBM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用于后面的單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)。

1.2.2 雨生紅球藻細(xì)胞密度及胞外有機(jī)碳質(zhì)量濃度的測定

取10 mL濃度為0.34×107個/mL的雨生紅球藻無菌藻液，將其接種至100 mL BBM液體培養(yǎng)基中，于25℃、光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s)下靜置培養(yǎng)。隔天取1 mL無菌藻液，用光學(xué)顯微鏡和血球計數(shù)板測定藻細(xì)胞個數(shù)。另取5 mL藻液于8 000 r/min離心5 min，上清通過0.2 μm濾膜過濾除菌，用有機(jī)碳分析儀測定胞外有機(jī)碳(Extracellular organic carbon，EOC)的質(zhì)量濃度。測定條件為：載氣為超純氧氣，壓力0.3 MPa，溫度1 100℃。

1.2.3 TD16在雨生紅球藻EOC中的生長

將TD16接種于PDA固體培養(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)5 d，用20 mL無菌水沖洗斜面，過濾菌絲，得到TD16孢子懸浮液。將培養(yǎng)14 d的雨生紅球藻無菌藻液離心，上清通過0.2 μm濾膜過濾除菌，與等體積BBM液體培養(yǎng)基混合，對照組為BBM液體培養(yǎng)基，接種100 μL TD16孢子懸浮液，28℃、110 r/min搖床培養(yǎng)。用有機(jī)碳分析儀測定EOC質(zhì)量濃度的變化，TD16的生長情況由OD580表示。

1.2.4 雨生紅球藻單獨培養(yǎng)及與TD16混合培養(yǎng)

用血球計數(shù)板將培養(yǎng)5 d即生長到對數(shù)期的雨生紅球藻藻細(xì)胞濃度調(diào)整至1×107個/mL、TD16孢子懸浮液濃度調(diào)整至1.36×107個/mL。取10 mL藻液分別與2、1、0.5 mL TD16孢子懸浮液按5∶ 1、10∶ 1、20∶ 1體積比接種至100 mL BBM液體培養(yǎng)基，用BBM液體培養(yǎng)基將接種量補(bǔ)齊至12 mL。對照組加10 mL藻液與2 mL BBM液體培養(yǎng)基，于25℃、光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s)下靜置培養(yǎng)，每日手搖3次，每組設(shè)3個平行。

1.2.5 生物量、平均生長速率、平均比生長速率和倍增時間的測定

生物量即細(xì)胞干重的測定參考Cho等[21]的方法并加以改動。向混合培養(yǎng)液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的十二烷基硫酸鈉超聲并低速離心，使藻細(xì)胞與菌絲分離，烘干稱得藻細(xì)胞干重。平均比生長速率(μ)、平均生長速率(r)和倍增時間(DT)[22]由下式計算。

(1)

(2)

(3)

式中：X0和Xn分別為微藻細(xì)胞在培養(yǎng)時間t0和tn時的藻細(xì)胞干重,g/L。

1.2.6 雨生紅球藻油脂含量及脂肪酸組成分析

取25 mg烘干研磨后的藻粉懸浮于5 mL氯仿-甲醇(體積比2∶ 1)提取液中，在100 Hz下超聲提取10 min，然后8 000 r/min離心10 min，重復(fù)提取分離3次，合并氯仿相，揮干溶劑，烘干稱重，計算油脂含量。油脂平均合成速率(r1)、平均比合成速率(q)[22]由下式計算。

(4)

(5)

式中：X0、G0和Xn、Gn分別為雨生紅球藻在培養(yǎng)時間t0和tn時的生物量和油脂含量。

將2 mL 1%硫酸-甲醇溶液加入烘干至恒重的油脂中，80℃水浴鍋中加熱60 min，取出冷卻至室溫，加入5 mL去離子水和2 mL正己烷，8 000 r/min離心10 min，收集上清液。沉淀加入1 mL正己烷繼續(xù)提取，離心將2次上清液合并，氮氣吹干。用0.5 mL正己烷重新溶解，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，用氣相色譜儀分析脂肪酸組成。色譜條件：DB-23(安捷倫)毛細(xì)管柱；起始溫度為80℃，采用程序升溫以12℃/min升至140℃，再以4℃/min升至240℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測器溫度280℃；載氣流量80 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。

1.2.7 硝態(tài)氮質(zhì)量濃度測定[23]

將硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品烘干至恒重，配制成質(zhì)量濃度為0、50、100、150、200、250、300 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0.1 mL 于試管中，加入0.4 mL 5%的水楊酸-濃硫酸溶液，于室溫下顯色25 min后向其中加入9.5 mL 8%的氫氧化鈉溶液，搖勻，冷卻至室溫，測定410 nm下的吸光度，以硝酸鈉質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)擬合得回歸方程Y=0.096 62X-0.010 26。

將雨生紅球藻培養(yǎng)液離心，取0.1 mL上清液于試管中，按上述方法測定410 nm下的吸光度，通過硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出硝態(tài)氮質(zhì)量濃度。

1.2.8 葉綠素a質(zhì)量濃度的測定

參照Wellburn[24]的方法。取2 mL雨生紅球藻培養(yǎng)液，離心棄上清，將微藻細(xì)胞懸浮于90%的甲醇溶液中，于50℃水浴30 min，8 000 r/min離心10 min，收集上清液。以90%甲醇為對照，測定上清液于652 nm和665 nm處的吸光度(A)，通過式(6)得出葉綠素a的質(zhì)量濃度(Chla)。

Chla=16.82×A665-9.28×A652

(6)

1.2.9 蝦青素質(zhì)量濃度和含量的測定

蝦青素質(zhì)量濃度的測定參考文獻(xiàn)[25]。取5 mL樣品，于5 000 r/min下離心10 min，棄上清，將藻細(xì)胞懸浮于含有5 g/100 mL KOH的3 mL甲醇中，于70℃水浴加熱5 min，離心去上清(除葉綠素)。用5 mL二甲基亞砜提取至藻細(xì)胞無色，測定提取物在490 nm處的吸光度(OD490)，用下式計算蝦青素的質(zhì)量濃度(C)。所有步驟均在黑暗中進(jìn)行。蝦青素含量=蝦青素質(zhì)量濃度/生物量。

C=(4.5×OD490×Va)/Vb

(7)

式中:Va為二甲基亞砜的體積；Vb為雨生紅球藻樣品的體積。

2 結(jié)果與討論

2.1 雨生紅球藻EOC的變化及TD16代謝EOC進(jìn)行生長的情況

藻細(xì)胞在光合自養(yǎng)過程中會分泌EOC[16]。雨生紅球藻細(xì)胞密度和EOC質(zhì)量濃度的變化如圖1所示，TD16利用雨生紅球藻EOC生長和EOC質(zhì)量濃度變化如圖2所示。

圖1 雨生紅球藻細(xì)胞密度及EOC質(zhì)量濃度的變化

圖2 TD16在EOC中的生長及EOC質(zhì)量濃度的變化

由圖1可見，雨生紅球藻EOC質(zhì)量濃度隨藻細(xì)胞生物量的增加而增加，當(dāng)藻細(xì)胞生長進(jìn)入到穩(wěn)定期，EOC質(zhì)量濃度也逐漸趨于平穩(wěn)，最大值為162.33 mg/L。由圖2可見，TD16與雨生紅球藻混合培養(yǎng)，TD16的生物量隨培養(yǎng)時間延長不斷增加，且隨著TD16的生長EOC質(zhì)量濃度不斷降低，表明藻細(xì)胞分泌的EOC可以被TD16利用，為TD16與雨生紅球藻在光合自養(yǎng)條件下混合培養(yǎng)提供了基礎(chǔ)。

2.2 雨生紅球藻與TD16接種比例的確定

藻菌混合比例是影響體系中微藻生長的重要因素，本研究設(shè)置3組不同藻菌比(體積比)以確定最佳混合比例，結(jié)果如表1所示。

表1 藻菌比對雨生紅球藻生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)率的影響

注：培養(yǎng)時間14 d。

由表1可見：混合培養(yǎng)與單獨培養(yǎng)相比，藻菌比為10∶ 1時對生物量的促進(jìn)作用最明顯，此時生物量為0.97 g/L，比單獨培養(yǎng)提高31.08%；藻菌比為5∶ 1時油脂含量提高明顯，為20.07%，比單獨培養(yǎng)提高16.62%；油脂產(chǎn)率在藻菌比為5∶ 1時最高，達(dá)到了182.64 mg/L。因此，為提高油脂產(chǎn)率，以下實驗均采用藻菌比5∶ 1進(jìn)行研究。

2.3 雨生紅球藻生物量和動力學(xué)參數(shù)的變化

雨生紅球藻單獨培養(yǎng)和與TD16混合培養(yǎng)過程中生物量的變化如圖3所示，藻細(xì)胞生長的動力學(xué)參數(shù)如表2所示。

圖3 雨生紅球藻生物量的變化

培養(yǎng)方法平均生長速率/(mg/(L·d))平均比生長速率/d-1倍增時間/d單獨培養(yǎng)47.32±2.390.163±0.0194.26±0.236混合培養(yǎng)62.30±4.310.214±0.0233.24±0.144

注：培養(yǎng)時間14 d。

由圖3可見，藻細(xì)胞生物量從第4天開始迅速增加，培養(yǎng)結(jié)束后，混合培養(yǎng)生物量為0.92 g/L，比單獨培養(yǎng)提高24.32%。由表2可見，混合培養(yǎng)中平均生長速率和平均比生長速率與單獨培養(yǎng)相比分別提高31.66%和31.29%，倍增時間縮短了23.94%?；旌吓囵B(yǎng)雨生紅球藻生物量提高的原因可能是TD16分泌促生長因子促進(jìn)了藻細(xì)胞的的生長。Voinove等[26]發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉可以分泌植物激素β-吲哚乙酸(IAA)，但楊婷等[27]提出淡紫擬青霉的促生長活性因子不是IAA。我們前期實驗證明TD16發(fā)酵液可明顯促進(jìn)植物生長[20]，經(jīng)硫酸銨分級沉淀和SDS-PAGE確定促生長因子為蛋白類物質(zhì)。與此一致，夏漢祥等[28]發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉對菜心種子生長具有顯著的促進(jìn)作用，并確定其產(chǎn)生的類植物生長素為水溶性蛋白質(zhì)。此外，雨生紅球藻單獨培養(yǎng)過程中由于光合作用導(dǎo)致培養(yǎng)液中O2濃度上升而CO2濃度下降，二者均導(dǎo)致光合作用效率下降[25]，與其他藻-菌混合培養(yǎng)相似[6,22,25]，混合培養(yǎng)過程中TD16吸收O2釋放CO2，并且TD16的菌絲有利于藻細(xì)胞附著，提高了菌絲和藻細(xì)胞之間的氣體傳質(zhì)效率[16]，促進(jìn)了光合作用。

2.4 培養(yǎng)液中硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的變化

雨生紅球藻單獨培養(yǎng)和與TD16混合培養(yǎng)培養(yǎng)液中硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的變化如圖4所示。

圖4 培養(yǎng)液中硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的變化

由圖4可見，混合培養(yǎng)和單獨培養(yǎng)培養(yǎng)液中硝態(tài)氮質(zhì)量濃度均在培養(yǎng)前期迅速下降，到第4天分別下降了77.85%和62.79%，第4天后緩慢下降，另外混合培養(yǎng)硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的下降速度明顯快于單獨培養(yǎng)，說明混合培養(yǎng)過程中TD16提高了硝態(tài)氮的代謝速率。

2.5 培養(yǎng)液pH的變化

用pH計測定了雨生紅球藻單獨培養(yǎng)和與TD16混合培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液pH的變化，結(jié)果如圖5所示。

圖5 培養(yǎng)液中pH的變化

2.6 雨生紅球藻葉綠素a質(zhì)量濃度的變化

為了研究油脂合成與光合作用的關(guān)系，測定了雨生紅球藻單獨培養(yǎng)和與TD16混合培養(yǎng)葉綠素a質(zhì)量濃度的變化，結(jié)果如圖6所示。

圖6 雨生紅球藻葉綠素a質(zhì)量濃度的變化

2.7 雨生紅球藻油脂參數(shù)分析及脂肪酸組成的變化

培養(yǎng)14 d雨生紅球藻油脂含量、油脂產(chǎn)率和動力學(xué)參數(shù)如表3所示，脂肪酸組成分析結(jié)果如表4所示。

表3 雨生紅球藻油脂含量、油脂產(chǎn)率和動力學(xué)參數(shù)的分析

表4 雨生紅球藻脂肪酸組成及含量 %

由表3可見，混合培養(yǎng)與單獨培養(yǎng)相比雨生紅球藻的油脂含量、油脂產(chǎn)率、平均合成速率和平均比合成速率分別提高了16.97%、45.59%、45.64%和16.67%?；旌吓囵B(yǎng)過程中油脂產(chǎn)率的提高主要歸因于兩個方面，即生物量的提高和油脂合成速率的提高，后者的提高主要是由于混合培養(yǎng)過程中氮質(zhì)量濃度的快速下降導(dǎo)致的氮饑餓和TD16釋放CO2提高了反應(yīng)體系中CO2的濃度，二者均能提高油脂的合成速率[25]。

由表4可見，兩種培養(yǎng)方法雨生紅球藻油脂中脂肪酸組成基本相同，主要組分都為十六碳和十八碳脂肪酸，占總脂肪酸的72.17%～84.63%。混合培養(yǎng)與單獨培養(yǎng)相比，飽和脂肪酸從31.23%上升為32.54%，不飽和脂肪酸從68.77%下降為67.46%，其中C16∶ 0和C18∶ 1分別提高20.56%和19.27%，脂肪酸含量的改變可能是因為培養(yǎng)液中CO2和胞外有機(jī)物濃度的變化引起的[30]。

2.8 雨生紅球藻蝦青素的質(zhì)量濃度和含量的變化

蝦青素是脂溶性次級產(chǎn)物，當(dāng)培養(yǎng)液中硝態(tài)氮含量趨于0時才開始合成，為了研究油脂含量提高的同時蝦青素的變化，測定培養(yǎng)8 d后蝦青素的質(zhì)量濃度和含量，結(jié)果如圖7所示。

圖7 雨生紅球藻蝦青素的質(zhì)量濃度和含量

3 結(jié) 論

本研究確定了雨生紅球藻與TD16混合培養(yǎng)的最佳接種比例，并證明混合培養(yǎng)過程中TD16能夠穩(wěn)定pH、促進(jìn)氮代謝和葉綠素的合成，提高雨生紅球藻的生物量、油脂產(chǎn)率、油脂平均合成速率和蝦青素含量。因此，雨生紅球藻與TD16混合培養(yǎng)為生物柴油的生產(chǎn)提供了一種新的反應(yīng)模式。