馬進(jìn)海， 馬淑娟， 汪 濤， 張王成

(1青海大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科， 2青海省人民醫(yī)院婦科， 青海 西寧 810000)

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見(jiàn)的原發(fā)性神經(jīng)上皮腫瘤，具有惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差和病死率高等特點(diǎn)，給患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅[1]。腦膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展及復(fù)發(fā)是一個(gè)多階段、多基因、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，目前基因治療成為研究熱點(diǎn)[2]。轉(zhuǎn)錄激活因子5(activating transcription factor 5，ATF5)是ATF/CREB家族的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖、凋亡、發(fā)育和分化等過(guò)程，國(guó)內(nèi)外研究顯示，ATF5在肝癌、乳腺癌和惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，其在腫瘤中作用機(jī)制復(fù)雜，涉及Wnt、PI3K和RAS/MAPK等信號(hào)途徑[3-5]。有研究顯示，人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染可上調(diào)惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ATF5表達(dá)，而干擾ATF5表達(dá)后的細(xì)胞活力明顯降低，凋亡率升高[6]，但相關(guān)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未明確。NF-κB為核轉(zhuǎn)錄因子，在腦膠質(zhì)瘤和肺癌等多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，其高表達(dá)影響腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生與進(jìn)展[7-8]。本研究旨在探討敲減ATF5表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及NF-κB信號(hào)的影響，以期為腦膠質(zhì)瘤的治療提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞、試劑和儀器

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞購(gòu)自ATCC。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco；抗ATF5、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)、 p-p65、p-IκB和Bax抗體購(gòu)自Abcam；MTT和PDTC試劑均購(gòu)自Sigma；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒和流式細(xì)胞儀均購(gòu)自BD。酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTek。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 U251細(xì)胞用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫、5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰酶消化后傳代。以1×109/L的密度接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的U251細(xì)胞于6孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞達(dá)80%～90%生長(zhǎng)融合時(shí)，參照Invitrogen的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明將制備的特異性ATF5 siRNA (siATF5)-Lipo2000復(fù)合物加入至6孔板，輕晃混勻后于37℃恒溫、5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育4～6 h后更換為完全培養(yǎng)基。收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞用于細(xì)胞凋亡及蛋白表達(dá)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分為siATF5組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染ATF5的特異性siRNA)、陰性對(duì)照(negative control, NC)組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA)和空白對(duì)照(blank)組(僅加入脂質(zhì)體)。

2.2MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 胰酶消化轉(zhuǎn)染siRNA后的各組細(xì)胞，配制成濃度為2×107/L的細(xì)胞懸液，以每孔200 μL接種于96孔板，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，觀察到細(xì)胞完成貼壁后，分別于24、48和72 h加入MTT溶液(5 mg/L)，每孔20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心，棄掉上清液，在每孔中加入100 μL的DMSO溶液。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染siRNA 48 h的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，參照Anne-xin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明，使用500 μL的binding buffer懸浮細(xì)胞，然后加入Annexin V-FITC 10 μL，于暗室中室溫溫育染色15 min，在上機(jī)前5 min加入5 μL的PI(10 mg/L)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀察細(xì)胞凋亡的百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白水平 在轉(zhuǎn)染siRNA 48 h的細(xì)胞中加入適量的預(yù)冷細(xì)胞裂解液制備成勻漿，離心，取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整樣品為相同濃度，加上樣緩沖液，于沸水中變性5 min，取變性蛋白50 μg，每孔道等量，經(jīng)10% SDS-PAGE分離，分離后的蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)好的膜用5%的脫脂奶粉封閉2 h，分別加抗ATF5、VEGF、COX-2、 p-p65、p-IκB、Bax和GAPDH抗體(皆按照1∶500稀釋)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，加1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的 II 抗室溫孵育1.5 h，洗膜，ECL發(fā)光劑顯色，X膠片曝光，拍照。以Quantity軟件分析目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH灰度值，以其比值作為各個(gè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5抑制NF-κB信號(hào)對(duì)U251細(xì)胞活力及凋亡的影響 U251細(xì)胞用siATF5轉(zhuǎn)染后采用NF-κB信號(hào)通路抑制劑PDTC(0.05 μmol/L)處理，細(xì)胞分為siATF5組和siATF5+PDTC組，收集處理48 h的2組細(xì)胞，通過(guò)MTT及Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞的活力及凋亡情況。方法同上。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ATF5轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)

siATF5組ATF5蛋白的表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，NC組ATF5蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

2 siATF5可抑制U251細(xì)胞活力

MTT結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染siATF5 24 h、48 h和72 h的U251細(xì)胞活力均明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

Figure 1. Relative protein expression of ATF5 in the U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖1 ATF5在轉(zhuǎn)染siATF5的U251細(xì)胞中的表達(dá)

表1 MTT檢測(cè)各組U251細(xì)胞活力

*P<0.05vsblank group.

3 siATF5可誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，siATF5組U251細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

4 siATF5可下調(diào)U251細(xì)胞免疫抑制因子VEGF和COX-2的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，siATF5組VEGF和COX-2蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

5 siATF5可下調(diào)U251細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子的蛋白水平

Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，siATF5組p-p65和p-IκB的蛋白水平顯著降低，Bax的蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 2. The apoptotic rate of the U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)siATF5轉(zhuǎn)染的各組U251細(xì)胞的凋亡率

Figure 3. The protein expression of VEGF and COX-2 was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖3 Western blot檢測(cè)VEGF和COX-2蛋白表達(dá)的變化

6 抑制NF-κB信號(hào)通路對(duì)U251細(xì)胞活力及凋亡率的影響

用siATF5和NF-κB信號(hào)通路抑制劑PDTC處理U251細(xì)胞，細(xì)胞活力及凋亡率的檢測(cè)結(jié)果顯示，siATF5+PDTC組的細(xì)胞活力(0.312±0.034)顯著低于siATF5組(0.544±0.051)，siATF5+PDTC組的細(xì)胞凋亡率顯著高于siATF5組(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

討 論

利用RNA干擾技術(shù)抑制目的癌基因表達(dá)，降低癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡，從而達(dá)到腫瘤治療目的，在治療惡性腫瘤中有很好的前景及應(yīng)用價(jià)值[9-10]。ATF5基因定位于19q13.3，屬于ATF/CREB核轉(zhuǎn)錄因子家族，其在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中有廣泛表達(dá)，干擾其表達(dá)可影響細(xì)胞存活[11]；HCMV感染可上調(diào)惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ATF5表達(dá)，而干擾ATF5表達(dá)后的細(xì)胞活力明顯降低，凋亡率升高[6]，以上研究提示抑制ATF5表達(dá)可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究中通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞ATF5表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力明顯降低，凋亡率升高，這與前人的研究結(jié)果一致。

Figure 4. The protein levels of NF-κB signaling pathway-related molecules were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖4 Western blot檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子的蛋白水平

Figure 5. The effect of PDTC on the apoptotic rate of U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiATF5 group.

圖5 抑制NF-κB信號(hào)通路對(duì)U251細(xì)胞凋亡率的影響

目前已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子可使機(jī)體發(fā)生免疫抑制，如TGF-β、VEGF和COX-2等[12]。大多數(shù)腫瘤可產(chǎn)生VEGF，從而促進(jìn)腫瘤血管生成[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清可降低樹(shù)突細(xì)胞分化，而這種抑制作用可被VEGF抗體阻斷[14]。COX-2可被細(xì)胞因子、癌基因、生長(zhǎng)因子和腫瘤細(xì)胞誘生，為前列腺素生物合成的限速酶，其表達(dá)過(guò)度與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系[15]。COX-2可通過(guò)上調(diào)caspase-3引起免疫細(xì)胞凋亡[16],還可通過(guò)抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)的產(chǎn)生間接引起白細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10)產(chǎn)生，進(jìn)而降低機(jī)體殺瘤免疫作用[17]。已有研究表明，抑制VEGF和COX-2表達(dá)可降低膠質(zhì)瘤免疫抑制[18-19]。本研究結(jié)果顯示，抑制ATF5表達(dá)可降低U251細(xì)胞VEGF和COX-2的表達(dá)，這提示ATF5表達(dá)抑制可能降低腦膠質(zhì)瘤免疫抑制。

NF-κB是一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，幾乎在所有細(xì)胞內(nèi)存在，近些年的研究顯示，NF-κB信號(hào)與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。多種實(shí)體腫瘤中NF-κB表達(dá)升高或呈持續(xù)激活狀態(tài)，且這些腫瘤普遍存在抵抗現(xiàn)象，預(yù)后差[20-21]。而有研究顯示，抑制NF-κB信號(hào)可降低腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[22]。激活A(yù)TF家族ATF3可通過(guò)結(jié)合NF-κB p65亞基抑制炎癥反應(yīng)[23]。ATF5是否參與調(diào)控NF-κB信號(hào)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)尚未清楚。Bax是Bcl-2家族成員，發(fā)揮促凋亡作用，腫瘤細(xì)胞活化的NF-κB可通過(guò)上調(diào)Bax表達(dá)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[24-25]，抑制ATF5表達(dá)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡與上調(diào)Bax表達(dá)有關(guān)[6]。本研究結(jié)果顯示，抑制ATF5表達(dá)可下調(diào)NF-κB信號(hào)通路p-p65和p-IκB表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，提示ATF5表達(dá)抑制誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤凋亡機(jī)制可能與NF-κB信號(hào)的下調(diào)有關(guān)。