柯曉蘋， 張啟國， 林維嘉， 蔡良奇

(廈門大學附屬第一醫(yī)院皮膚科, 福建 廈門 361000)

增生性瘢痕是皮膚組織受到損傷后過度愈合而形成的，其以成纖維細胞過度增殖及凋亡減少、膠原沉積為主要病理特征，嚴重影響著人們的生活質量，其一直是整形、燒傷及創(chuàng)傷修復領域急需解決的問題[1]。DKK3 (dickkopf homolog 3) 是DKKs蛋白家族的成員之一[2],目前已知DKK3參與腫瘤、心臟病和脂肪肝等疾病的發(fā)生，具有負調控細胞增殖并促進細胞凋亡的作用[3-5]。研究顯示，DKK3在人瘢痕疙瘩組織中表達水平低于正常皮膚組織，并且其表達水平的高低還與組織內膠原蛋白的合成水平有關，而對于DKK3在人增生性瘢痕成纖維細胞增殖凋亡及膠原合成中的作用尚不明確[6]。我們的實驗以明確DKK3在人增生性瘢痕成纖維細胞增殖凋亡及膠原合成中的作用為目的，以期為闡明增生性瘢痕形成分子機制提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料

采集2017年6月廈門大學附屬第一醫(yī)院收治的5例增生性病理瘢痕組織及切除的正常皮膚組織，組織浸泡于生理鹽水中，組織標本采集經過倫理學委員會批準。pcDNA3.1-DKK3由上海吉瑪公司構建；激活型caspase-9(cleaved caspase-9)抗體購自Cell Signaling Technology；cDNA合成試劑盒購自Thermo；BCA蛋白定量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；抗Ⅱ型膠原(collagen type II, COL II)和I型膠原(collagen type I, COL I)抗體購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；抗細胞色素C(cytochrome C)和激活型caspase-3(cleaved caspase-3)抗體購自Abgent；胞質蛋白提取試劑盒和線粒體蛋白提取試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。

2 方法

2.1增生性瘢痕成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞分離培養(yǎng) 參照文獻[7]取增生性病理瘢痕組織和正常皮膚組織，放置于玻璃平皿中，添加含有1%青、鏈霉素的PBS溶液，用眼科剪把脂肪組織和表皮組織剪去，添加PBS洗滌3次以后，在組織中添加少量血清，將組織剪碎成約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，置于無菌條件下，放置于25 cm2的培養(yǎng)瓶瓶底，將培養(yǎng)瓶倒置放置，培養(yǎng)5 h。添加6 mL的含20%胎牛血清和1%青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，間隔2 d進行換液，顯微鏡下觀察細胞爬出后，將皮膚組織去掉，繼續(xù)培養(yǎng)。細胞融合度為80%時用0.25%的胰蛋白酶傳代。選取第3代細胞用于后續(xù)實驗。

2.2慢病毒感染和細胞分組 取增生性瘢痕成纖維細胞，在細胞中添加含有pcDNA3.1-DKK3的重組慢病毒和陰性對照慢病毒，MOI=10，培養(yǎng)24 h后換液。3 d后觀察綠色熒光蛋白表達情況，感染效率高于90%，用于后續(xù)實驗。把含有pcDNA3.1-DKK3的重組慢病毒和陰性對照慢病毒感染后的細胞命名為DKK3組和vector組，把不添加慢病毒的細胞作為正常對照(control)組。

2.3RT-qPCR測定過表達效果 取control、vector和DKK3組細胞，用TRIzol法提取細胞中的總RNA，根據cDNA合成試劑盒反轉錄，用SYBR進行熒光定量PCR。PCR體系為：0.6 μL的20×Super Green染料，0.3 μL的5×106U/L的Cap Taq，0.4 μL的上下游引物，10 μL的2×PCR Buffer for Super Green，6.3 μL的去離子水，2.0 μL的cDNA。PCR程序為：94 ℃變性15 s；58 ℃退火15 s；72 ℃延伸20 s；76 ℃熒光檢測3 s，75 ℃～95 ℃熔解曲線。DKK3上游引物序列為5’-ATGCAGCGGCTTGGGGCCACCCTGCTGTGC-3’，下游引物序列為5’-GATGTCCCATTGCTGCCCCTGGTGGCCAT-3’; β-actin上游引物序列為5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，下游引物序列為5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。

2.4Western blot測定過表達效果 取control、vector和DKK3 3組細胞，用RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白。所提取的蛋白樣品與2×Loading Buffer混合以后，放在沸水中反應5 min。以BCA蛋白定量檢測試劑盒對蛋白進行定量。分別配制10%的分離膠10 mL和5%的濃縮膠4 mL，每個孔中添加25 μg的蛋白樣品，預染Marker添加5 μL。在濃縮膠中電壓設置為80 V，在分離膠中電壓設置為100 V。取出大小合適的NC膜，以17 V電壓轉膜30 min后，置于TBST中漂洗3次，把NC膜放在抗體孵育盒中，分別與DKK3 Ⅰ抗反應液在4℃反應過夜以后，再與HRP標記的Ⅱ抗反應液在室溫中孵育30 min。用ECL法發(fā)光，Image Lab分析條帶的灰度值，DKK3蛋白半定量分析以β-actin作為內參照。

2.5MTT方法測定細胞增殖活性變化 將control、vector和DKK3 3組細胞分別種植在96孔板中，48 h后，在細胞中加入100 μL的MTT溶液，放在孵育箱中培養(yǎng)4 h后，把上清吸棄，繼續(xù)添加100 μL的DMSO溶液，振蕩反應5 min以后，把酶標儀波長調整為570 nm，分析各孔吸光度(A)值，以不含細胞的空白孔調零以后，計算細胞的存活率，把control細胞存活率設置為100%。

2.6流式細胞術測定細胞凋亡變化 取control、vector和DKK3細胞，以1 500×g離心10 min后，收集細胞，以2 mL的PBS將細胞重懸洗滌3次以后，用Binding Buffer 400 μL將細胞沉淀懸浮，添加Annexin V-FITC以及PI溶液各5 μL，放置于室溫條件下反應15 min。用流式細胞儀測定細胞凋亡變化。

2.7Western blot測定細胞中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、COL II、COL I及胞質、線粒體中cytochrome C蛋白表達的變化 取control、vector和DKK3 3組細胞，用RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白，分別用胞質和線粒體蛋白提取試劑盒提取胞質和線粒體蛋白。COL II、COL I、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和胞質中cytochrome C蛋白半定量分析以β-actin作為內參照，線粒體中cytochrome C蛋白定量以Porin作為內參照。

3 統(tǒng)計學分析

實驗數據采用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，多組差異比較采用單因素方差分析，組間比較用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 DKK3在增生性瘢痕成纖維細胞中低表達

DKK3在增生性瘢痕成纖維細胞中的表達水平低于正常皮膚組織(P<0.05),見圖1。

Figure 1. Low expression of DKK3 in hypertrophic scar fibroblasts. A: the mRNA expression of DKK3 in hypertrophic scar fibroblasts and normal skin fibroblasts; B: Western blot was used to detect the expression of DKK3 protein in hypertrophic scar fibroblasts and normal skin fibroblasts. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group.

圖1 DKK3在增生性瘢痕成纖維細胞中低表達

2 pcDNA3.1-DKK3對細胞中DKK3表達影響

在增生性瘢痕成纖維細胞中感染pcDNA3.1-DKK3慢病毒后，細胞中的DKK3 mRNA和蛋白表達水平均升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. Upregulation of DKK3 expression in hypertrophic scar fibroblasts transfected with DKK3 overexpression vector. A: the mRNA expression ofDKK3; B: Western blot was used to detect the expression of DKK3 protein. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 DKK3過表達載體轉染后細胞中DKK3表達上調

3 過表達DKK3抑制增生性瘢痕成纖維細胞活力

過表達DKK3后的增生性瘢痕成纖維細胞活力降低(P<0.05)，見圖3。

4 過表達DKK3誘導增生性瘢痕成纖維細胞凋亡

過表達DKK3后的增生性瘢痕成纖維細胞凋亡率升高(P<0.05),見圖4。

5 過表達DKK3誘導增生性瘢痕成纖維細胞中cleaved caspase-9和cleaved caspase-3表達

過表達DKK3后的增生性瘢痕成纖維細胞中cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)，見圖5。

Figure 3. Changes of the cell viability after overexpression of DKK3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 過表達DKK3后細胞活力的變化

Figure 4. Apoptotic changes after overexpression of DKK3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 過表達DKK3后細胞凋亡的變化

Figure 5. Expression of cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3 in cells after DKK3 overexpression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 過表達DKK3后細胞中cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白表達水平

6 過表達DKK3促進增生性瘢痕成纖維細胞線粒體釋放cytochrome C

過表達DKK3后的增生性瘢痕成纖維細胞胞質中cytochrome C蛋白水平升高(P<0.05)，線粒體中cytochrome C蛋白水平降低(P<0.05),見圖6。

Figure 6. Changes of cytochrome C protein expression in cytoplasm and mitochondrion after overexpression of DKK3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6 過表達DKK3后胞質和線粒體中cytochrome C蛋白表達的變化

7 過表達DKK3減少增生性瘢痕成纖維細胞合成COL II和COL I

過表達DKK3后的增生性瘢痕成纖維細胞中COL II和COL I蛋白水平降低(P<0.05)，見圖7。

Figure 7. Expression of COL II and COL I after DKK3 overexpression was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖7 過表達DKK3后細胞合成的COL II和COL I的變化

討 論

人類DKKs蛋白家族含有多個成員，其中DKK3是與其它成員差別較大的一個調控因子，DKK3具有誘導細胞凋亡和抑制細胞生長的作用，在肝母細胞瘤、肝癌和宮頸癌等腫瘤中已經證實[8-13]。目前的研究顯示，DKK3與增生性瘢痕組織形成有關，其在瘢痕組織中的表達水平異常降低，并且其表達水平的高低與組織中Bax等凋亡蛋白的表達水平有關[6,14]。我們的實驗結果表明，過表達DKK3后的增生性瘢痕成纖維細胞存活率降低，細胞凋亡率升高，說明過表達DKK3具有抗增生性瘢痕細胞生長并誘導凋亡的作用，這證實DKK3在增生性瘢痕組織形成中發(fā)揮抑制作用，明確了DKK3在增生性瘢痕組織形成中的作用，為以后研究增生性瘢痕組織形成機制提供了參考資料。

我們的實驗結果還顯示，高表達DKK3后的增生性瘢痕細胞中的cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表達水平升高，同時線粒體中cytochrome C蛋白表達水平降低，胞質中cytochrome C蛋白水平升高，提示高表達DKK3具有促進線粒體釋放cytochrome C和激活caspase凋亡反應的作用。當細胞受到相關信號刺激以后，cytochrome C通過線粒體膜進入到胞質中，而胞質中的cytochrome C可以與caspase-9結合，共同誘導caspase凋亡反應的發(fā)生，線粒體釋放cytochrome C也是線粒體凋亡途徑發(fā)生的關鍵[15-16]。caspase-9和caspase-3是細胞凋亡的激活和執(zhí)行因子，它們以酶原的形式存在于細胞內，只有被活化后才可以誘導細胞凋亡發(fā)生，caspase-3活化標志著細胞凋亡進入不可逆的階段[17]。我們的實驗可能提示，DKK3能夠通過促進線粒體中cytochrome C釋放，誘導caspase反應發(fā)生，最終誘導細胞凋亡發(fā)生，這初步闡明了DKK3在增生性瘢痕細胞凋亡中的作用機制。

增生性瘢痕組織形成與成纖維細胞膠原合成有關，存在于瘢痕組織中的成纖維細胞合成的膠原和氨基聚糖等細胞外基質的能力是正常成纖維細胞的4倍左右，COL II和COL I是增生性瘢痕成纖維細胞合成的主要膠原蛋白，其具有促進增生性瘢痕形成的作用[18-20]。本結果表明，DKK3可以減少增生性瘢痕成纖維細胞中COL II和COL I蛋白表達，這可能提示，DKK3可能通過抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡最終減少細胞合成膠原。

總之，DKK3在增生性瘢痕組織中發(fā)揮抑制作用，其可能通過cytochrome C/caspase途徑誘導細胞凋亡并抑制細胞增殖從而降低細胞合成膠原能力，這對于研究DKK3在增生性瘢痕發(fā)生中的作用機制提供了參考。我們只在體外進行了細胞實驗，對于DKK3的分子靶向調控網絡尚不明確，需在以后的實驗中進行完善和補充。