黃玉鑫,馮 鑫,史文鑫,劉 偉,付 哲,焦凌霞

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

酸性果汁pH較低,大多數(shù)細(xì)菌不能在其中生長繁殖,而酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)具有嗜酸、耐熱、產(chǎn)芽孢、強(qiáng)抗逆性等生理生化特征,其芽孢能經(jīng)受傳統(tǒng)的巴氏滅菌過程而存活,一旦外界條件適宜就會(huì)萌發(fā)生長,使果汁產(chǎn)品出現(xiàn)沉淀且產(chǎn)生難聞氣味,喪失商品價(jià)值[1]。該菌屬最早在巴氏滅菌蘋果汁中發(fā)現(xiàn)[2],隨后相繼在橙汁、番茄汁、菠蘿汁、西番蓮汁、葡萄汁、芒果汁及罐裝番茄丁等產(chǎn)品中檢出[3-5]。1998年的美國食品加工商協(xié)會(huì)(NFPA)報(bào)告顯示,35% 的果汁污染與嗜酸芽孢桿菌有關(guān),而引起酸性果汁腐敗的嗜酸芽孢桿菌主要是酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌[6]。

歐洲果汁協(xié)會(huì)2011年的調(diào)查發(fā)現(xiàn),45%的果汁生產(chǎn)企業(yè)發(fā)生過脂環(huán)酸芽孢桿菌污染引起的腐敗事件[7]。美國佛羅里達(dá)州市售的180種熱帶和亞熱帶的水果濃縮汁中,6.1%的樣品存在脂環(huán)酸芽孢桿菌污染現(xiàn)象[8]。Oteiza等[9]調(diào)查發(fā)現(xiàn),阿根廷市售的果汁產(chǎn)品中,11.4%的蘋果汁樣品的脂環(huán)酸芽孢桿菌檢測(cè)結(jié)果為陽性,而草莓汁樣品的陽性檢測(cè)結(jié)果高達(dá)83.3%。由脂環(huán)酸芽孢桿菌引起的腐敗在多個(gè)國家相繼出現(xiàn),給果汁加工業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究認(rèn)為消除酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染是防止酸性飲料變質(zhì)的關(guān)鍵,國際出口貿(mào)易中嚴(yán)格要求每10 mL濃縮果汁中該菌的含量不大于1個(gè)[6],因此酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的控制已成為食品研究領(lǐng)域普遍關(guān)注的問題。

本文概述了酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌特性、危害、鑒定與檢測(cè)及抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢萌發(fā)生長的物理、化學(xué)及理化結(jié)合的方法的研究進(jìn)展,分析了多種酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌危害控制措施的優(yōu)缺點(diǎn),以期為果汁生產(chǎn)及保藏提供理論指導(dǎo)。

1 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的特性

1982年,德國發(fā)生的大規(guī)模果汁污染事件使人們意識(shí)到引起果汁變質(zhì)的罪魁禍?zhǔn)字饕撬嵬林h(huán)酸芽孢桿菌。酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌嗜酸耐熱,屬于革蘭氏染色陽性非致病菌,生長pH范圍是3.0～6.0,生長溫度范圍為26～60 ℃。菌體形態(tài)呈桿狀,長2～6.3 μm,寬0.35～1.1 μm[10]。在生長環(huán)境條件不利時(shí)會(huì)生成橢圓形芽孢,其大小為長1.5～1.8 μm,寬0.9～1.0 μm[11]。營養(yǎng)菌體在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6 h便可達(dá)到對(duì)數(shù)期,培養(yǎng)48 h以上形成芽孢。將菌種接種至固體培養(yǎng)基,45 ℃培養(yǎng)24～48 h形成菌體乳白色、邊緣較整齊的圓形菌落,直徑為0.5～5 mm[12]。

該菌主要存在于土壤或酸性果汁中,具有很強(qiáng)的逆境適應(yīng)能力。其耐熱性主要和三個(gè)方面有關(guān):特殊的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。脂環(huán)酸芽孢桿菌屬的細(xì)胞膜中含有比較罕見的ω-環(huán)狀脂肪酸和藿烷類化合物結(jié)構(gòu)，這一特殊結(jié)構(gòu)成為細(xì)胞膜的防護(hù)層,使其能夠在極端環(huán)境如高溫、低pH條件下生長繁殖[13]；遺傳物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。研究表明,嗜熱菌DNA中的氫鍵數(shù)量與堿基對(duì)的G-C含量高于嗜溫菌。嗜溫菌堿基對(duì)的G-C含量一般為44.9%,脂環(huán)酸芽孢桿菌屬堿基對(duì)的G-C含量一般為51.6%～64.3%,故其熱穩(wěn)定性較高[14]；大分子物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。很多嗜熱菌中的蛋白質(zhì)及酶類物質(zhì)均有熱穩(wěn)定性,使其在熱環(huán)境下可穩(wěn)定生長[15]。

2 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的危害

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在不利于營養(yǎng)菌體生長的條件下形成中生芽孢、近端芽孢或終端橢圓形芽孢[16],酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌及其芽孢可污染果汁生產(chǎn)中的半成品和生產(chǎn)材料,包括果汁和加工用水等。而且該菌污染初期不容易被發(fā)現(xiàn),一旦環(huán)境適宜,其芽孢就會(huì)迅速萌發(fā)為營養(yǎng)菌體進(jìn)而生長繁殖導(dǎo)致果汁產(chǎn)品出現(xiàn)沉淀且產(chǎn)生難聞氣味。酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的腐敗代謝產(chǎn)物主要包括愈創(chuàng)木酚和鹵酚(2.6-二溴苯酚和2.6-二氯苯酚),此類代謝物質(zhì)會(huì)散發(fā)出“煙熏味”、“藥味”、“消毒水” 等不良風(fēng)味。引起果汁腐敗惡臭味的主要代謝物質(zhì)是愈創(chuàng)木酚,當(dāng)菌體含量達(dá)到105～106cfu/mL時(shí),便可聞到不良風(fēng)味,導(dǎo)致產(chǎn)品喪失商品價(jià)值[12,17]。因此,食品工業(yè)亟需有效、簡單和快速的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌檢測(cè)方法及控制芽孢污染的措施。

圖1 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物主要成分Fig.1 Main metabolic product of Alicyclobacillus acidoterrestris注:(a)愈創(chuàng)木酚；(b)2,6-二溴苯酚；(c)2,6-二氯苯酚。

3 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的鑒定與檢測(cè)

目前,對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢測(cè)有傳統(tǒng)方法和現(xiàn)代鑒定技術(shù)兩類。傳統(tǒng)的鑒定檢測(cè)一般以形態(tài)特征(G+、產(chǎn)芽孢、白色、圓形菌落)、生長條件(pH、溫度)及生理生化鑒定(API 50CHB系統(tǒng))等作為依據(jù)。從分子水平上進(jìn)行鑒定的常用方法有DNA組成、雜交試驗(yàn)和16S rDNA序列分析,其中,16S rDNA序列分析法被公認(rèn)為是很好的譜系分析“分子尺”。另外,還有些研究使用甲基萘醌分析及細(xì)胞膜脂肪酸組分分析等特征作為鑒定依據(jù)。傳統(tǒng)鑒定檢測(cè)方法一般需要4～5 d才能得到結(jié)果,指標(biāo)多、程序繁瑣、工作量大、檢測(cè)結(jié)果滯后、不能滿足果汁企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌屬污染情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的需求。

現(xiàn)代鑒定技術(shù)有傅立葉紅外光譜檢測(cè)(FT-IR)、PCR、16S rDNA序列分析、免疫學(xué)快速檢測(cè)、代謝產(chǎn)物分析等方法。Lin等[18]利用近紅外光譜對(duì)8株脂環(huán)酸芽孢桿菌進(jìn)行鑒定,建立了適用于脂環(huán)酸芽孢桿菌鑒別分析的光譜模型,其鑒別準(zhǔn)確率達(dá)到了89%。Goto等[19]通過16S rDNA可變區(qū)分析方法可將不同脂環(huán)酸芽孢桿菌進(jìn)行種間區(qū)分。近年來,PCR檢測(cè)方法由于其特異性高,檢測(cè)時(shí)間相對(duì)縮短等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的鑒定和檢測(cè)[20-21]?；赑CR技術(shù)的檢測(cè)方法特異性強(qiáng),靈敏度高,但需要菌體富集培養(yǎng)和PCR擴(kuò)增才能對(duì)低菌體濃度的樣本進(jìn)行檢測(cè),所需檢測(cè)時(shí)間仍較長,并未實(shí)現(xiàn)真正意義上的快速檢測(cè)[22]。岳田利等[23]利用免疫磁微球?qū)χh(huán)酸芽孢桿菌進(jìn)行特異性分離富集,通過ELISA檢測(cè)體系對(duì)目標(biāo)菌體進(jìn)行定性檢測(cè),具有檢測(cè)限低、時(shí)效性和準(zhǔn)確性更可靠的優(yōu)點(diǎn)。張宇霞等[24]成功制備了酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌單克隆抗體,可用于進(jìn)一步研制膠體金試紙條及ELISA試劑盒,有望用于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的在線定性及定量檢測(cè)。

愈創(chuàng)木酚是脂環(huán)酸芽孢桿菌的代表性代謝產(chǎn)物,其含量高、揮發(fā)性強(qiáng),可通過對(duì)代謝產(chǎn)物的檢測(cè)來分析脂環(huán)酸芽孢桿菌的污染,目前采用的方法主要有頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法(SPME-GC-MS)及電子鼻、電子舌技術(shù)[25-27]。這些技術(shù)容易受果汁中有機(jī)成分及微生物菌群的干擾,降低檢測(cè)靈敏度,背景值高、結(jié)果判讀不準(zhǔn)確,不利于檢測(cè)方法的常規(guī)應(yīng)用和大規(guī)模推廣[28]。因此,優(yōu)化脂環(huán)酸芽孢桿菌屬快速分離與檢測(cè)技術(shù)體系,排除背景干擾,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)樣本的有效富集,為進(jìn)一步利用現(xiàn)代技術(shù)保障果汁品質(zhì)及質(zhì)量安全奠定理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

4 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌危害控制

4.1 物理法控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌

巴氏殺菌是果汁企業(yè)最常用的滅菌消毒法,可有效控制果汁中常見的酵母菌、乳酸桿菌和霉菌等,但酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌具有獨(dú)特的嗜酸耐熱特性,其芽孢經(jīng)巴氏殺菌(92 ℃,10 s)處理仍能夠存活,在蘋果汁中的D值范圍為D90 ℃=11.1 min至D100 ℃=0.7 min[29],對(duì)果汁工業(yè)的滅菌工藝提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。目前,用于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的物理殺滅技術(shù)主要有熱處理、高壓處理、超聲波、紫外處理、歐姆加熱等。

4.1.1 熱處理 由于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的高抗逆性,高溫處理一直是控制其污染的主要方法。Lopez等[30]將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢置于時(shí)間溫度積分儀中,模擬工業(yè)加熱過程,快速加熱至93 ℃,保持2 min,發(fā)現(xiàn)在緩沖液中芽孢數(shù)下降約2 lg cfu/mL,在橘子汁中芽孢數(shù)下降約1 lg cfu/mL。但熱處理會(huì)使果汁產(chǎn)品風(fēng)味劣變、營養(yǎng)損失、感官品質(zhì)下降,因此,果汁工業(yè)亟待開發(fā)快速高效且能有效保存果汁營養(yǎng)成分的芽孢污染控制技術(shù)。

4.1.2 高壓處理 高壓滅菌是無需加熱的新型食品保藏技術(shù),可最大限度地保留食品中的營養(yǎng)成分。普通的高壓處理僅能殺滅酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)菌體,對(duì)芽孢的殺滅效果較差[31]。超高壓技術(shù)最高壓力可達(dá)400 MPa,可以在常溫甚至低溫下起到殺菌的作用[32]。Roig-Sagues等[33]以300 MPa的壓強(qiáng)處理酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(CECT 7094)芽孢,盡管芽孢數(shù)下降了5 lg cfu/mL,但其滅菌效果不僅受果汁中糖和可溶性固形物含量的影響,處理溫度和時(shí)間也影響其有效性。Bevilacqua等[34]研究發(fā)現(xiàn),50～170 MPa的高壓對(duì)DSMZ 2498、C4和C8三株脂環(huán)酸芽孢桿菌的營養(yǎng)菌體和芽孢的抑制效果均不顯著。

4.1.3 超聲波處理 超聲波殺菌技術(shù)通過空化作用,引起局部高溫、高壓及產(chǎn)生自由基等一系列后續(xù)效應(yīng)使微生物細(xì)胞受到破壞甚至死亡,但是該方法對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的抑制效果不佳。Tremarin等[35]發(fā)現(xiàn),用330 W、30 kHz的超聲波處理濃度為105cfu/mL的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢,10 min后芽孢數(shù)僅下降了0.12 lg cfu/mL。胡貽春[36]研究發(fā)現(xiàn)用500 W超聲波處理蘋果汁30 min時(shí),對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的致死率最高可達(dá)80%左右,但蘋果汁中總糖的含量降低了1.163 g/100 mL;運(yùn)用700 W超聲波處理蘋果汁60 min時(shí),其透光度從95%以上降低至70%以下(國標(biāo)要求透光度不小于95%),因此采用超聲波殺菌需在殺菌之后進(jìn)行澄清處理,操作更加繁瑣。

4.1.4 紫外處理 紫外殺菌屬于冷殺菌,常應(yīng)用于果汁殺菌,可以很好的保存果汁中的營養(yǎng)成分,但所需光譜范圍為100～400 nm,對(duì)設(shè)備要求較高[37]。Tremarin等[38]利用7種不同強(qiáng)度的紫外光分別處理酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體及其芽孢,發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加,菌體數(shù)量均呈線性遞減,當(dāng)紫外強(qiáng)度達(dá)到13.44 W/m2時(shí),其芽孢數(shù)降低了5lg cfu/mL。紫外處理與其他物理方法相比,殺菌效果最好,可以最大限度地殺滅酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體及芽孢,但是也有研究報(bào)道紫外線對(duì)不同種類果汁中微生物的殺菌效果有很大區(qū)別[39],且針對(duì)懸浮物較多的果汁產(chǎn)品,其殺菌工藝參數(shù)需要進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整,因此,紫外處理應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中的果汁產(chǎn)品殺菌仍有待進(jìn)一步的研究。且該法對(duì)儀器的要求較高,成本也相應(yīng)提高,中小型企業(yè)不易實(shí)施。

4.1.5 歐姆加熱處理 歐姆加熱使電流通過物料內(nèi)部,將電能轉(zhuǎn)化為熱能,溫度升高,達(dá)到直接均勻加熱殺菌的目的[40]。Baysal等[41]應(yīng)用歐姆加熱法對(duì)橘子汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢進(jìn)行殺菌處理,在電壓梯度為50 V/cm、90 ℃熱處理10 min后發(fā)現(xiàn)芽孢致死率比傳統(tǒng)加熱滅菌法處理時(shí)提高了4個(gè)數(shù)量級(jí)。耿敬章等[42]研究了歐姆加熱對(duì)蘋果汁中酸土脂環(huán)芽孢桿菌的殺滅作用,結(jié)果表明溫度為70 ℃,電壓為250 V,pH為3.5時(shí)殺菌率高達(dá)90%以上,且歐姆加熱對(duì)蘋果汁的各項(xiàng)理化指標(biāo)(如pH、透光率、色值和糖度等)無明顯影響,因此極具開發(fā)前景。

4.2 化學(xué)法控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢

目前,用于控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的防腐劑主要包括苯甲酸及苯甲酸鹽、臭氧、亞氯酸、中性電解水及一些天然化合物如乳酸鏈球菌素(Nisin)、迷迭香提取物、石榴提取物等。

4.2.1 化學(xué)制品

4.2.1.1 苯甲酸及苯甲酸鹽 苯甲酸與苯甲酸鹽是常用的防腐劑,兩者在酸性環(huán)境中極易進(jìn)入細(xì)胞,改變細(xì)胞的通透性,起到防腐的作用,其不足之處是在堿性環(huán)境下會(huì)失去抑菌效果[43]。Bevilacqua等[34]將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌c8和γ4的芽孢分別接種于苯甲酸鈉培養(yǎng)液中培養(yǎng),結(jié)果表明添加500 ppm的苯甲酸鈉,c8芽孢的萌發(fā)率降低至16%,γ4芽孢萌發(fā)率雖有降低,但13 d后回升至60%。Walker等[44]研究發(fā)現(xiàn)將0.1 mg/mL苯甲酸鈉和山梨酸鉀添加至蘋果汁中,僅對(duì)10 cfu/mL的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌有抑制作用。Kawase等[45]在果汁中添加50 mg/L用超臨界技術(shù)處理過的苯甲酸微粒,于45 ℃培養(yǎng)28 d,發(fā)現(xiàn)其對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢殺滅效果相當(dāng)于2倍濃度未經(jīng)處理的苯甲酸鈉和苯甲酸顆粒,但此方法較費(fèi)時(shí)。

4.2.1.2 臭氧 臭氧是一種強(qiáng)氧化劑,能夠破壞微生物的膜結(jié)構(gòu),或與細(xì)菌細(xì)胞壁脂類的雙鍵反應(yīng),穿入菌體內(nèi)部,作用于蛋白和脂多糖,改變細(xì)胞的通透性,從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[46]。在22 ℃下,將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢置于含臭氧濃度為2.8和5.3 mg/L的無菌蘋果汁中,40 min后,芽孢數(shù)分別下降1.8、2.4 lg cfu/mL[47]。仇農(nóng)學(xué)等[48]研究發(fā)現(xiàn)臭氧濃度為31.1 mg/L的臭氧水對(duì)蘋果表面酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌作用15 min時(shí),殺菌率可達(dá)90%以上,且臭氧通氣的殺菌效果要好于臭氧水殺菌。低濃度的臭氧可在短時(shí)間內(nèi)殺滅大部分微生物,但臭氧有特殊的臭味且極不穩(wěn)定,當(dāng)接觸熱、光、有機(jī)物和水時(shí)易分解成氧氣或單個(gè)氧原子,最終使果汁產(chǎn)品中含氧量升高[49]。因此,臭氧應(yīng)用于果汁產(chǎn)品的殺菌工藝需要考慮后續(xù)的脫氧措施,否則有可能引起果汁營養(yǎng)成分的氧化損失及口感劣變。

4.2.1.3 亞氯酸 亞氯酸屬于強(qiáng)氧化劑,可改變細(xì)胞膜的通透性使胞內(nèi)K+、Mg2+和ATP等小分子物質(zhì)流出,同時(shí)細(xì)胞膜上的酶失活,從而抑制了蛋白質(zhì)的合成導(dǎo)致細(xì)胞菌體死亡[50]。亞氯酸可以有效抑制沙門氏菌與李斯特菌等食源性病原菌的生長,美國食品藥品監(jiān)督管理局已將亞氯酸列為農(nóng)產(chǎn)品原料可添加藥物[51]。Lee等[52]將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢接種于蘋果表面,并用亞氯酸處理蘋果,使用268 ppm濃度的亞氯酸處理20 min后,蘋果表面的芽孢數(shù)下降至2.0 lg cfu/mL。但亞氯酸很不穩(wěn)定,室溫下極容易分解,幾分鐘內(nèi)便可生成氯氣、二氧化氯和水,使其應(yīng)用范圍受到限制。

4.2.1.4 中性電解水 中性電解水(neutral electrolyzed water)是通過電解稀食鹽或稀鹽酸溶液制得的pH接近中性、含有的有效氯幾乎完全以次氯酸分子(HClO)存在的電解水。中性電解水綠色環(huán)保,對(duì)小鼠無毒害作用[53-54]。次氯酸分子較次氯酸根(ClO-)具有更強(qiáng)的殺菌能力,在有效氯濃度和處理時(shí)間相同的條件下,次氯酸分子對(duì)大腸桿菌的殺菌能力是次氯酸根(ClO-)的80～150倍[55]。Torlak[56]將200 μL濃度為106cfu/mL的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢均勻噴涂于蘋果表面,晾干后分別浸入游離氯離子濃度為200 mg/L的次氯酸鈉溶液和中性電解水中,當(dāng)浸泡時(shí)間為1、3、5 min時(shí),次氯酸鈉溶液中的芽孢數(shù)分別下降0.5lg、2.7lg、4.12lg cfu/mL,中性電解水中的芽孢數(shù)分別下降1.42lg、3.76lg、5.1lg cfu/mL。

4.2.2 天然化合物

4.2.2.1 乳酸鏈球菌素(Nisin) 乳酸鏈球菌素是一種天然防腐劑,無毒無害,可以有效抑制引起食品腐敗的革蘭氏陽性菌。Komitopoulou等[57]研究發(fā)現(xiàn)溫度為25 ℃時(shí),Nisin對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢最小抑菌濃度為5 IU/mL,當(dāng)溫度達(dá)到80～95 ℃時(shí),Nisin可使酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的D值下降40%。Yamazaki等[58]研究發(fā)現(xiàn) Nisin對(duì)高酸度果汁中的脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)體細(xì)胞和芽孢均有一定的抑制作用,可見介質(zhì)pH與Nisin對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑菌效果關(guān)系密切。但Nisin對(duì)蘋果清汁中的脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑制作用并不明顯,鑒于Nisin具有良好的熱穩(wěn)定性,在生產(chǎn)中常與熱處理結(jié)合使用。

4.2.2.2 迷迭香提取物 迷迭香具有抗氧化、抗菌、消炎等作用,從迷迭香的花和葉子中提取得到的迷迭香精油及抗氧化劑已廣泛用于醫(yī)學(xué)、工業(yè)以及食品方面[59-60]。Piskernik等[61]分別將V20與V40兩種迷迭香萃取物添加于含有105cfu/mL酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的蘋果汁中,8 h時(shí),芽孢數(shù)分別下降0.6和1.5lg cfu/mL,并且果汁的顏色,口感和氣味等沒有發(fā)生明顯的變化。

4.2.2.3 石榴提取物 石榴含有多種抗氧化性的物質(zhì),例如鞣花丹寧、花青素等,具有抗炎、清除自由基等作用[62]。Molva等[63]將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體與芽孢分別接種至含石榴提取物的無菌蘋果汁中,調(diào)整菌液濃度達(dá)到105cfu/mL,240 h后,試驗(yàn)組菌體數(shù)下降了約3.0lg cfu/mL,芽孢數(shù)下降了約1.6lg cfu/mL,且菌體與芽孢表面均有不同程度的凹陷。石榴提取物對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體有一定的抑制效果,但對(duì)該菌芽孢抑制效果較差且起到抑菌作用所需的時(shí)間較長,應(yīng)用于食品防腐仍需進(jìn)一步研究。

4.2.2.4 葡萄籽提取物 葡萄籽中含60%～70%的多酚物質(zhì),是一種天然的抗菌劑[64]。Molva等[65]將濃度為105cfu/mL的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體與芽孢分別重懸于添加葡萄籽提取物的無菌蘋果汁中,336 h之后,試驗(yàn)組菌體數(shù)量均下降約3.5lg cfu/mL,芽孢數(shù)下降約2.0lg cfu/mL,通過掃描電子顯微鏡觀察,菌體與芽孢表面均受到不同程度的損傷,出現(xiàn)凹陷。葡萄籽提取物能一定程度抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的營養(yǎng)菌體,但其抑菌效果較差且比較費(fèi)時(shí)。

4.2.2.5 胡椒提取物 胡椒是一種重要的香料物質(zhì),在食品工業(yè)中常作防腐劑、保鮮劑及抗氧化劑[66]。Ruiz等[67]研究發(fā)現(xiàn),胡椒中起到抑菌作用的主要成分為異戊烯基色烯,胡椒提取物對(duì)于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的最低抑菌濃度及殺菌濃度為7.8 μg/mL,相同濃度下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢數(shù)與對(duì)照組相比下降約1lg cfu/mL。

4.3 理化結(jié)合法控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢

常用的物理及化學(xué)方法對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)菌體有一定的抑制效果,但是對(duì)于該菌芽孢的抑制作用較差。因此探究理化結(jié)合法對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的抑制效果成為熱點(diǎn)。

4.3.1 熱處理與乳酸鏈球菌素(Nisin)結(jié)合 由于該菌芽孢有極強(qiáng)的耐熱特性,單一熱處理無法將其殺滅,80 ℃以上的高溫甚至?xí)せ钛挎呙劝l(fā),進(jìn)一步提高殺菌溫度則導(dǎo)致果汁營養(yǎng)成分遭受損失[29]。而Nisin在5 IU/mL的濃度下便可抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的營養(yǎng)體的生長,但對(duì)該菌芽孢的抑制作用較差[68]。Zhang等[69]將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢置于含不同濃度的Nisin培養(yǎng)液中培養(yǎng),同時(shí)利用無線電方式加熱,發(fā)現(xiàn)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的致死率與溫度、加熱時(shí)間及Nisin的濃度呈正相關(guān)。Nisin添加量為75 IU/mL,90 ℃處理10 min時(shí)為最佳條件,芽孢數(shù)下降4lg cfu/mL,結(jié)果表明熱處理與Nisin協(xié)同處理提高了對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的抑制作用,但此條件下影響果汁口感,營養(yǎng)成分損失嚴(yán)重。

4.3.2 高壓處理與Nisin結(jié)合 Sokolowska等[70]使用高壓處理酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的同時(shí)加入Nisin,發(fā)現(xiàn)Nisin添加量為250 IU/mL 時(shí),在45 ℃、200 MPa條件下處理45 min,芽孢數(shù)從6 lg cfu/mL降為2lg cfu/mL,不僅有效地殺滅酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢,同時(shí)也降低了能耗。

4.3.3 高壓處理與苯甲酸結(jié)合 苯甲酸在食品中的添加量不得大于1 g/L,而此范圍內(nèi)的苯甲酸并不能完全抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的萌發(fā)[33]。Bevilacqua等[71]將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢置于80 mg/L苯甲酸的蘋果汁中,同時(shí)進(jìn)行140 MPa高壓處理,44 ℃培養(yǎng)1 d后,發(fā)現(xiàn)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(DSMZ 2498)芽孢數(shù)下降了2lg cfu/mL。

5 展望

用于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬的控制方法頗多,物理、化學(xué)及理化相結(jié)合的方法對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢都有一定的抑制效果。目前,實(shí)際生產(chǎn)中主要還是采用物理方法進(jìn)行脂環(huán)酸芽孢桿菌污染控制。物理方法雖在一定程度上能夠殺滅該菌營養(yǎng)菌體和芽孢,但成本高能耗高,且無法徹底、有效殺滅該菌,其中的臭氧、超高壓滅菌等技術(shù)仍處于研究階段。化學(xué)法的抑制效果較物理法有所提升,但起到抑制效果所需的作用時(shí)間較長。單一的物理及化學(xué)法均不能有效控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢污染引起的腐敗變質(zhì)。理化相結(jié)合的方法在一定程度上可有效減少酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢數(shù),但有些方法對(duì)儀器設(shè)備的要求較高,其應(yīng)用在中小型企業(yè)受到限制。因此,果汁工業(yè)亟待開發(fā)快速高效且能有效保留果汁營養(yǎng)成分損失的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢污染控制技術(shù)。

休眠中的芽孢對(duì)外界環(huán)境非常敏感,當(dāng)芽孢萌發(fā)時(shí),就會(huì)失去極端抗性,相對(duì)容易被殺死。因此,芽孢萌發(fā)也是控制食品腐敗的重要階段。芽孢萌發(fā)過程極其復(fù)雜,不同種屬細(xì)菌的芽孢萌發(fā)所需條件各不相同。酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌具有嗜酸耐熱的雙重生理特性,其芽孢在低pH條件下也能萌發(fā),進(jìn)而生長繁殖引起酸性食品腐敗變質(zhì)。隨著對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢萌發(fā)特點(diǎn)及調(diào)控機(jī)制的探究,篩選能夠有效抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢萌發(fā)的抑制劑,開辟控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢污染的新技術(shù),不僅為有效控制該菌芽孢污染及酸性水果產(chǎn)品保藏提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù),同時(shí)在控制醫(yī)源、食物源芽孢桿菌等方面也有著重要意義。