酶解法提取紫薯原花青素工藝優(yōu)化

韓卓,李慧，馬龍

(蚌埠學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院,安徽 蚌埠 233030)

紫薯，又叫黑薯、紫心甘薯等，于20世紀(jì)90年代從日本引進(jìn)[1]，肉質(zhì)呈紫色至深紫色。紫薯中含有的人體必需的賴氨酸和礦物質(zhì)元素銅、錳、鋅等含量較普通的甘薯高3～8倍，而硒元素含量高達(dá)20倍左右[2]。除含有普通甘薯所含的多糖、氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分外，還富含原花青素、黃酮等生物活性成分，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)高于普通甘薯，具有預(yù)防高血壓、減輕肝機(jī)能障礙、預(yù)防心血管疾病、清除人體自由基、抗癌等多種保健功能[3-8]。目前對(duì)于紫薯的利用仍以鮮食為主，對(duì)紫薯生物活性成分的研究和深加工報(bào)道并不多。

原花青素(proanthocyanidins，PC) 是一種有著特殊結(jié)構(gòu)的生物類(lèi)黃酮混合物，主要存在于偏紅色或紫色的植物中，是一種強(qiáng)效的天然自由基清除劑[9]，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品等領(lǐng)域。作為食品調(diào)料，廣泛添加于飲料、酒等食品中，不僅具有防腐抑菌的功效，還可提升食品的營(yíng)養(yǎng)保健功能[10]。目前市售的商品原花青素基本來(lái)源于葡萄籽提取物，而葡萄籽原花青素的穩(wěn)定性相對(duì)較差。因此，本研究以紫薯塊根為原料，采用酶解法提取再經(jīng)響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，期望對(duì)紫薯原花青素的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯：市售，低溫烘干后粉碎備用。

無(wú)水乙醇(分析純)：安徽安特食品股份有限公司；檸檬酸、鹽酸(分析純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉(分析純)：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；正丁醇、甲醇(分析純)：天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸鐵氨(分析純)：上海展云化工有限公司；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥95%)：上海金穗生物科技有限公司；纖維素酶(10000 U/g)：上海原生態(tài)生物科技有限公司；中性蛋白酶(100000 U/g)：上海凱爾生物科技有限公司；α-淀粉酶(40000 U/g)：索萊寶公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；XFB-200高速中藥粉碎機(jī) 吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FA-14電子天平 上海?？惦娮觾x器廠；PHS-25型酸度計(jì) 上海宵盛儀器制造有限公司；KQ-300E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；H4-20KR離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[11]

配制0.2 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取0，2，4，6，8，10 mL分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋成濃度分別為0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14 mg/mL。吸取每個(gè)容量瓶中的溶液1～10 mL具塞試管中加入0.2 mL的2%硫酸鐵氨溶液、6 mL的鹽酸-正丁醇溶液，搖勻，放置沸水中水浴30 min，取出放入冷水中冷卻10 min。然后用紫外分光光度計(jì)在546 nm處測(cè)其吸光度，以原花青素質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)檢測(cè)的吸光度值(y)為縱坐標(biāo)，繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 原花青素的提取工藝流程

新鮮的紫薯清洗切片，烘干粉碎過(guò)篩，準(zhǔn)確稱(chēng)量1 g紫薯粉于錐形瓶中，加入一定體積純水，加入一定量的酶，加檸檬酸調(diào)節(jié)pH后，置于超聲波清洗機(jī)中提取功率400 W、一定溫度下酶解提取一定時(shí)間，提取液4000 r/min離心15 min，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫減壓濃縮[12]，用甲醇定容至25 mL，即得到樣品提取液。

根據(jù)原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出樣品提取液中的原花青素濃度，計(jì)算原花青素的提取率，計(jì)算公式如下：

式中：C為紫薯花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g；P為原花青素提取率。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別考察不同酶種類(lèi)(纖維素酶、α-淀粉酶、中性蛋白酶)及濃度(50，100，150，200，250 μg/mL)、酶解溫度(25，35，45，55，65 ℃)、酶解時(shí)間(20，35，50，65，80 min)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、pH(4，5，6，7，8)對(duì)紫薯中原花青素提取率的影響。

在單因素試驗(yàn)結(jié)果分析基礎(chǔ)上，基于Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)曲面法對(duì)紫薯中原花青素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，選取3個(gè)因子pH(C)、酶解時(shí)間(A)、酶解溫度(B)為自變量，以原花青素提取率(Y)為響應(yīng)面值，并以1，0，-1分別代表自變量的高、中、低水平，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因子與水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以原花青素質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)檢測(cè)的吸光度值(y)為縱坐標(biāo)，繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 原花青素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of procyanidians content

由圖1可知，原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=3.4196x-0.0005，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996，表明原花青素質(zhì)量濃度在0～0.04 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 不同酶類(lèi)及用量對(duì)提取率的影響

不同酶類(lèi)及用量對(duì)提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同酶類(lèi)及用量對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of different enzyme types and dosage on extraction rate

由圖2可知，3種酶類(lèi)對(duì)紫薯原花青素提取率r 影響為纖維素酶>α-淀粉酶>中性蛋白酶，中性蛋白酶對(duì)原花青素提取率的影響最小，這與紫薯所含蛋白質(zhì)成分較少有關(guān)，纖維素酶對(duì)原花青素提取率的影響最大，這是因?yàn)槔w維素酶能夠酶解植物細(xì)胞壁，有利于細(xì)胞內(nèi)容物的溶出。隨著纖維素酶濃度的增加，原花青素提取率也逐漸增大，當(dāng)纖維素酶添加量達(dá)到150 μg/mL時(shí)，提取率達(dá)到5.025%，加酶量繼續(xù)增加時(shí)原花青素提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明紫薯細(xì)胞壁中纖維素酶酶解完全，過(guò)多的酶量反而會(huì)影響原花青素的溶出，故選擇纖維素酶濃度為150 μg/mL做進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.2 酶解溫度對(duì)提取率的影響

酶解溫度對(duì)提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate

由圖3可知，酶解溫度在30～40 ℃范圍時(shí)，紫薯原花青素提取率隨溫度升高而呈上升趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度達(dá)40 ℃時(shí)，提取率為5.035%；溫度繼續(xù)升高時(shí)提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是由于溫度過(guò)高會(huì)影響酶的活性，此外原花青素?zé)岱€(wěn)定性較差，導(dǎo)致提取率下降，故選擇40 ℃做進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction rate

由圖4可知，酶解時(shí)間在20～65 min范圍時(shí)，紫薯原花青素提取率隨時(shí)間延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)65 min時(shí)，提取率為5.027%；隨著時(shí)間繼續(xù)增加，提取率趨于穩(wěn)定，說(shuō)明紫薯細(xì)胞壁基本酶解完全，原花青素有效溶出，故選擇65 min做進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.4 料液比對(duì)提取率的影響

料液比對(duì)提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 料液比對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid on extraction rate

由圖5可知，料液比在1∶10～1∶30范圍時(shí)，紫薯原花青素提取率隨料液比增加而升高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶30時(shí)，提取率達(dá)5.019%；隨著料液比的增加，提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)楫?dāng)提取劑量過(guò)多時(shí)，反而會(huì)影響酶的催化作用，故選擇1∶30做進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.5 pH對(duì)提取率的影響

pH對(duì)提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 pH對(duì)提取率的影響Fig.6 Effect of pH on extraction rate

由圖6可知，pH在4～6范圍時(shí)，紫薯原花青素隨著pH增加而升高，當(dāng)pH為6時(shí)，提取率達(dá)5.031%；隨著pH增加，提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)檫^(guò)高的pH影響了纖維素酶的活性，使得細(xì)胞壁酶解不完全，導(dǎo)致提取率下降，故選擇pH為6做進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平和結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平和結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及結(jié)果Table 2 Factors and levels and results of response surface experimental design

續(xù) 表

通過(guò)Design-Expert 10.0.7軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，得到原花青素提取率與酶解時(shí)間(A)、酶解溫度(B)、pH(C)的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=-4.45134+0.041727A+0.17658B+1.36348C+4.05000E-004AB-8.66667E-004AC-7.12500E-003BC-4.08667E-004A2-1.82200E-003B2-0.079450C2。

2.3.2 模型建立與方差分析

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注： “*”表示對(duì)結(jié)果影響顯著(P<0.05)；“**”表示對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.0001)。

表3回歸模型和方差分析結(jié)果顯示，因素A、B、C、AB、BC、A2、C2對(duì)紫薯原花青素提取率的影響達(dá)到顯著水平(P<0.005)，因素B2對(duì)紫薯原花青素提取率的影響極顯著(P<0.0001)。模型F值為54.20，P<0.0001，失擬項(xiàng)P值為0.0867>0.05，表明該模型顯著性極高，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明預(yù)估值和實(shí)測(cè)值之間擬合度較好。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9857、校正確定系數(shù)RAdj2=0.9677，表明該模型能夠解釋96.77%響應(yīng)值的變化，因此該模型可用于對(duì)紫薯原花青素提取率的分析和預(yù)測(cè)。根據(jù)F值大小判定，3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響的順序?yàn)锽(酶解溫度)>C(pH)>A(酶解時(shí)間)。

2.3.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)上述回歸方程繪制響應(yīng)面及等高線圖，分析酶解溫度、酶解時(shí)間和pH 3個(gè)因素對(duì)紫薯原花青素提取率的影響，響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖7。

圖7 酶解溫度、酶解時(shí)間和pH交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface plots of the effects of interaction between enzymatic hydrolysis temperature, enzymatic hydrolysis time and pH on extraction rate of proanthocyanidins

由圖7可知，酶解溫度和pH對(duì)應(yīng)的響應(yīng)曲面陡峭，說(shuō)明兩者交互作用較強(qiáng)；酶解時(shí)間和pH對(duì)應(yīng)的響應(yīng)曲面較為平緩，說(shuō)明這兩因素交互作用較弱，這與表3顯著性分析結(jié)果一致。在酶解溫度和pH對(duì)應(yīng)等高線圖中，等高線沿酶解溫度降低方向密集，增高方向稀疏，說(shuō)明降低溫度會(huì)顯著影響紫薯原花青素的提取率。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面軟件Design-Expert 10.0.7進(jìn)行優(yōu)化，最佳提取工藝條件為酶解時(shí)間65.957 min、酶解溫度43.538 ℃、pH 6.269。根據(jù)實(shí)際操作情況做相應(yīng)調(diào)整，確定最佳提取工藝條件為：酶解時(shí)間65 min、酶解溫度43 ℃、pH 6.2，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)際提取率為5.039%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該模型建立可靠，可用于對(duì)紫薯原花青素提取條件的優(yōu)化。

3 結(jié)論

本研究采用酶解法提取紫薯原花青素，纖維素酶的加入有利于紫薯細(xì)胞壁的破碎，促進(jìn)胞內(nèi)原花青素的溶出。在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以提取率為響應(yīng)值，建立紫薯原花青素提取率的二次回歸模型，確定最佳工藝條件為酶解時(shí)間65 min、酶解溫度43 ℃、pH 6.2，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證測(cè)得原花青素提取率為5.039%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明采用此工藝條件參數(shù)可靠，適合于提取紫薯中原花青素的工業(yè)化生產(chǎn)。