響應(yīng)面優(yōu)化小麥淀粉抗老化酶解工藝

王柱，史騰軒，王思宇，亓鑫，董墨思，冀迎昕，劉垚彤，李蘇紅

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

世界上每年都會(huì)出現(xiàn)因?yàn)榈矸劾匣速M(fèi)大量糧食的現(xiàn)象，因此研究淀粉老化問(wèn)題顯得尤為迫切[1-2]。淀粉老化是其線性分子通過(guò)氫鍵重新組合生成不溶的沉淀物[3]。目前抑制淀粉老化多采用添加糖類[4-5]、乳化劑[6-7]、親水膠體[8-9]及酶水解法[10-11]來(lái)減緩淀粉老化問(wèn)題，其中酶解作用效果顯著且綠色無(wú)污染，備受淀粉抗老化研究者的關(guān)注。姬娜等[12]發(fā)現(xiàn)G4淀粉酶能作用于淀粉支鏈產(chǎn)生四糖，以此降低支鏈淀粉側(cè)鏈的長(zhǎng)度延緩老化；孫玲玲等[13]、邱潑等[14]采用β-淀粉酶對(duì)糯米回生、米粉老化現(xiàn)象進(jìn)行研究，β-淀粉酶作為一種端切酶，從淀粉分子的非還原末端依次切下麥芽糖分子，從而縮短支鏈淀粉的外鏈長(zhǎng)度抑制淀粉回生；此外，王辛等[15]利用α-淀粉對(duì)傳統(tǒng)糕團(tuán)類淀粉老化進(jìn)行研究。本研究擬通過(guò)凍融穩(wěn)定性、膨脹度和溶解度比較分析β-淀粉酶和G4淀粉酶對(duì)小麥淀粉老化特性影響的差異及二者之間是否存在協(xié)同作用，結(jié)果表明兩者都對(duì)淀粉老化有一定的抑制作用，但兩者對(duì)淀粉老化的影響無(wú)顯著差異，且兩者的協(xié)同效果不顯著。從實(shí)際生產(chǎn)的角度選擇價(jià)格低廉的β-淀粉酶酶解小麥淀粉的條件進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，以期為酶解法在淀粉抗老化領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥淀粉：南京甘汁園糖業(yè)有限公司；β-淀粉酶（70萬(wàn)U/mL）：浙江仁和生物科技有限公司；G4淀粉酶（20萬(wàn)U/mL）：河南慶飛食品配料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9070S電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)：寧波樂(lè)電儀器制造有限公司；JD100-4電子天平：沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；TDL-5離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

稱取80 g小麥淀粉，與220 mL蒸餾水在燒杯中用玻璃棒攪均，放入58℃的水浴鍋糊化20 min，冷卻至室溫25℃，向其中加入淀粉酶，放在40℃的水浴鍋水浴30 min，不停地?cái)嚢枋姑赋浞址磻?yīng)，反應(yīng)完全后在100℃下滅酶2.5 min，溫度降至室溫25℃。將樣品倒入500 mL離心瓶，于3 000 r/min離心20 min[16]，取下層濕淀粉勻稱地涂抹在錫紙上，然后將涂有樣品的錫紙置于60℃干燥箱干燥12 h，將干燥后的樣品與錫紙分離，研磨，制備得到樣品。

1.3.2 凍融穩(wěn)定性測(cè)定

小麥淀粉與蒸餾水混合配成濃度6%的乳液，100℃水浴20 min，溫度降至室溫25℃；將小麥淀粉放入容量10 mL的離心管中，放于-18℃冷凍24 h，然后室溫25℃下融化8 h。于3 000 r/min離心20 min，將上清液與沉淀物分離，計(jì)算沉淀物的重量，計(jì)算析水率。平行測(cè)定3次。析水率計(jì)算公式如下：

式中：D 為析水率，%；A1為淀粉糊質(zhì)量，g；A2為沉淀物質(zhì)量，g。

1.3.3 溶解度、膨脹度測(cè)定

將小麥淀粉與蒸餾水混合配成濃度6%的乳液，于85℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，然后于3 000 r/min的條件下離心20 min，膨脹淀粉為淀粉糊的下部，隨即將上層的清澈的液體與淀粉糊分離開(kāi)來(lái)，然后干燥，便得到水溶淀粉，然后利用水溶液淀粉的質(zhì)量計(jì)算出溶解度。溶解度、膨脹度計(jì)算公式如下：

式中：S為溶解度，%；E為膨脹度，%；A1為水溶淀粉質(zhì)量，g；A2為淀粉樣品質(zhì)量，g；A3為膨脹淀粉質(zhì)量，g。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 酶解時(shí)間對(duì)小麥淀粉抗老化的影響

按1.3.1的方法對(duì)小麥淀粉進(jìn)行糊化，然后加入0.2%的淀粉酶，分別在 60 ℃水解 5、15、25、35、45、55 min后，沸水浴滅酶2.5 min。離心20 min、干燥后測(cè)定樣品的凍融穩(wěn)定性、溶解度和膨脹度的變化。

1.4.2 酶解溫度對(duì)小麥淀粉抗老化的影響

按上1.3.1的方法對(duì)小麥淀粉進(jìn)行糊化，然后加入0.2%的淀粉酶，分別在 40、45、50、55、60、65 ℃ 酶解30 min后，沸水浴滅酶2.5 min。離心20 min、干燥后測(cè)定樣品的凍融穩(wěn)定性、溶解度和膨脹度的變化。

1.4.3 加酶量對(duì)小麥淀粉抗老化的影響

按1.3.1的方法對(duì)小麥淀粉進(jìn)行糊化，然后分別加入0.05%、0.10%、0.20%、0.25%、0.30%的淀粉酶，60℃水解30 min。離心20 min、干燥后測(cè)定樣品的凍融穩(wěn)定性、溶解度和膨脹度的變化。

1.5 復(fù)配試驗(yàn)

稱取80 g小麥淀粉，與220 mL蒸餾水在燒杯中用玻璃棒攪均，放入58℃的水浴鍋糊化20 min，冷卻至室溫25℃。然后向其中加淀粉酶，ck1為只添加了0.15%的β-淀粉酶，ck2為只添加了0.2%的G4淀粉酶，其他組是在添加了0.15%β-淀粉酶的基礎(chǔ)上分別添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%的 G4淀粉酶，放在60℃水浴鍋反應(yīng)35 min，樣品處理方式同1.3.1。

1.6 響應(yīng)面優(yōu)化酶解淀粉抗老化工藝

使用Design-Expert 8.0軟件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，自變量分別是加酶量、時(shí)間、酶解溫度，A、B、C分別表示加酶量、時(shí)間、酶解溫度，自變量的高、中、低水平分別用1、0、-1表示，分別以小麥淀粉的析水率、溶解度和膨脹度為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與因素水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素與因素水平Table 1 Experimental factors and factors level

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2013，顯著性分析采用SPSS16.0，響應(yīng)面優(yōu)化采用Design Expert8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解時(shí)間對(duì)小麥淀粉抗老化的影響

淀粉顆粒吸水膨脹，溶解度和膨脹度的升高，氫鍵強(qiáng)度減弱，抑制分子之間相互吸引，延緩淀粉重結(jié)晶。析水率能夠反映淀粉的凍融穩(wěn)定性，凍融后析水率越低說(shuō)明抑制淀粉老化的效果越明顯。G4淀粉酶和β-淀粉酶處理小麥淀粉隨時(shí)間的變化如圖1。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)小麥淀粉抗老化的影響Fig.1 The effect of enzymatic hydrolysis time on the inhibiting retrogradation of wheat starch

G4淀粉酶在酶解時(shí)間為45 min時(shí)，溶解度和膨脹度最高分別為16.2%和64.4%，而析水率最低為55.7%。β-淀粉酶在酶解時(shí)間為35 min時(shí)，溶解度和最高分別為16.1%，而析水率最低55%。酶解時(shí)間在35 min～45 min以前，隨著酶解時(shí)間的增加，淀粉的溶解度和膨脹度增加，析水率下降。一旦酶解時(shí)間超過(guò)35 min～45min時(shí)隨著時(shí)間的繼續(xù)增加淀粉的溶解度和膨脹度都有明顯的下降趨勢(shì)，而析水率升高。β-淀粉酶在55 min時(shí)的析水率略低于45 min，但仍高于35 min時(shí)。這是因?yàn)殡S時(shí)間的延長(zhǎng)，酶對(duì)淀粉老化的抑制效果趨于完全，抑制淀粉老化的效果不明顯[17]。

通過(guò)對(duì)比可知，G4淀粉酶處理后的小麥淀粉的溶解度和膨脹度比原小麥淀粉分別上升了9.45%和22.2%，析水率下降了12.7%。β-淀粉酶處理后的小麥淀粉的溶解度和膨脹度比原小麥淀粉分別上升了9.3%和30.5%，析水率下降了13.4%。與空白組比較，結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，酶解時(shí)間對(duì)小麥淀粉的抗老化效果具有極顯著影響（P＜0.01），且兩種酶的作用效果無(wú)顯著差異段，從單因素的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在酶解時(shí)間25 min～35 min時(shí)，兩種酶的抗老化效果趨勢(shì)最好，一旦超過(guò)這一時(shí)間抗老化的效果變差，因此選擇30 min作為最優(yōu)條件。

2.2 酶解溫度對(duì)小麥淀粉抗老化的影響

酶解溫度對(duì)小麥淀粉抗老化的影響見(jiàn)圖2。

圖2 酶解溫度對(duì)小麥淀粉抗老化的影響Fig.2 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on inhibiting retrogradation of wheat starch

由圖2可知，酶解溫度逐漸達(dá)到淀粉酶作用效果最佳時(shí)的溫度，此時(shí)淀粉抗老化效果最好，淀粉的溶解度和膨脹度都達(dá)到頂峰，析水率達(dá)到最低值。G4淀粉酶在酶解溫度60℃時(shí)，溶解度和膨脹度最高分別為14.2%和64.4%，而析水率最低為50%。β-淀粉酶在酶解溫度為55℃時(shí)，溶解度和膨脹度最高分別為13.25%和53.3%，而析水率最低為45.1%。但超過(guò)50℃，酶的活力降低或部分喪失，淀粉的溶解度和膨脹度下降，析水率升高。

通過(guò)對(duì)比可知G4淀粉酶處理后的小麥淀粉的溶解度和膨脹度比原小麥淀粉分別上升了7.4%和22.2%，析水率下降了18.4%。β-淀粉酶處理后的小麥淀粉的溶解度和膨脹度比原小麥淀粉分別上升了6.4%和11.1%，析水率下降了23.3%。結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，酶解溫度對(duì)小麥淀粉的抗老化效果具有極顯著影響（P＜0.01），且兩種酶的作用效果無(wú)顯著差異。酶解溫度在50℃～55℃時(shí)，淀粉酶抗老化效果最優(yōu)，一旦超過(guò)這一溫度抗老化效果變差，因此選擇52.5℃作為最優(yōu)條件。

2.3 加酶量對(duì)小麥淀粉抗老化的影響

加酶量對(duì)小麥淀粉抗老化的影響見(jiàn)圖3。

圖3 加酶量對(duì)小麥淀粉抗老化的影響Fig.3 The effect of enzyme dosage on inhibiting retrogradation of wheat starch

圖3表明，G4淀粉酶在加酶量為0.2%時(shí)，β-淀粉酶在添加量為0.15%時(shí)，溶解度和膨脹度最高均為12.7%和53.3%，且析水率最低。經(jīng)過(guò)G4淀粉酶酶解后小麥淀粉的析水率降到37.9%，其結(jié)果與姬娜等[12]的研究結(jié)果一致。β-淀粉酶處理的析水率則為57.4%。伴隨著加酶量的逐漸增多，酶解程度增大達(dá)到頂峰，之后趨于水平。加酶量在0.1%～0.15%時(shí)，抗老化效果最好，一旦超過(guò)這一添加量抗老化效果變差，因此選擇加酶量為0.13%作為最優(yōu)條件。

通過(guò)對(duì)比可知G4淀粉酶和β-淀粉酶處理后的小麥淀粉的溶解度和膨脹度都比原小麥淀粉分別上升5.9%和11.1%。G4淀粉酶處理的析水率下降了30.5%，β-淀粉酶處理的析水率下降了11%。結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，加酶量對(duì)小麥淀粉的抗老化效果具有極顯著影響（P＜0.01），且兩種酶的作用效果無(wú)顯著差異。

2.4 復(fù)配試驗(yàn)的方差分析

G4淀粉酶與β-淀粉酶復(fù)配試驗(yàn)的顯著性分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 G4淀粉酶與β-淀粉酶復(fù)配Fig.4 Complex of G4 amylase and β-amylase

將其他試驗(yàn)組、ck2組與ck1組進(jìn)行顯著性分析，只有析水率一個(gè)指標(biāo)顯著，且兩者復(fù)配作用的效果不顯著，從實(shí)際生產(chǎn)的角度，選擇價(jià)格低廉的β-淀粉酶進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

由單因素試驗(yàn)結(jié)果分析可知影響小麥淀粉酶解的因素主要有3個(gè)：加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度，試驗(yàn)采用三因素三水平響應(yīng)面法優(yōu)化β-淀粉酶酶解小麥淀粉工藝參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Experimental scheme and results of response surface

析水率結(jié)果的方差分析：使用二次模型擬合各因素與析水率的關(guān)系，模型的P＜0.000 1，說(shuō)明這個(gè)試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著。失擬項(xiàng)P=0.071 0＞0.05，表明結(jié)果不顯著，但是該方程對(duì)試驗(yàn)的擬合程度好，該試驗(yàn)方案可行。析水率受因素 A2、B2、C2的作用極明顯（P＜0.01）。析水率受因素AB、BC、AC的交互作用后的結(jié)果不明顯。根據(jù)一次回歸方程系數(shù)的絕對(duì)值比較可得，對(duì)析水率影響因素的主次為：酶解時(shí)間＞加酶量＞酶解溫度，回歸方程見(jiàn)表3。

溶解度結(jié)果的方差分析：使用二次模型擬合各因素與溶解度的關(guān)系，模型的P＜0.001，證明這個(gè)試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著。失擬項(xiàng)P=0.584 1＞0.05，不顯著，表明該方程對(duì)試驗(yàn)的擬合度好，該方案可行。溶解度受因素A2、C2的作用均極明顯（P＜0.01）；溶解度受B2的作用明顯（P＜0.05）。溶解度受因素AB、BC、AC交互作用后的結(jié)果不明顯。根據(jù)一次回歸方程系數(shù)的絕對(duì)值比較可得，影響溶解度因素的主次為：酶解時(shí)間＞加酶量＞酶解溫度，回歸方程見(jiàn)表3。

膨脹度結(jié)果的方差分析：使用二次模型擬合各因素與膨脹度的關(guān)系，模型的P＜0.05，說(shuō)明這個(gè)試驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著。失擬項(xiàng)P=0.058 5＞0.05，不顯著，說(shuō)明該方程對(duì)試驗(yàn)的擬合度好，該方案可行。因素A2、B2對(duì)膨脹度的作用明顯（P＜0.05）；C2對(duì)膨脹度的作用不明顯。膨脹度受因素AB、BC、AC交互作用后的結(jié)果不顯著。根據(jù)一次回歸方程系數(shù)的絕對(duì)值比較可得，影響膨脹度因素的主次為：酶解時(shí)間＞加酶量＞酶解溫度，回歸方程見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)值對(duì)因素的回歸方程Table 3 Regression equation of response value pairs

2.5.1 各因素交互作用對(duì)析水率的影響

各因素交互作用對(duì)析水率的影響見(jiàn)圖5。

由圖5a可知，酶解時(shí)間和加酶量的逐漸增加，小麥淀粉的析水率先降低后升高，等高線的形狀趨近于圓形，析水率受時(shí)間和加酶量的交互作用后變化不明顯。由圖5b可知，加酶量和溫度的逐漸升高，析水率先降低然后有明顯的增加，等高線的形狀為橢圓形，這表明析水率受加酶量和溫度的作用顯著，由此可見(jiàn)，選擇合適的加酶量和溫度有利于淀粉的抗老化。同理，由圖5c可知，析水率受酶解時(shí)間與溫度的交互效應(yīng)后效果顯著。

圖5 各因素交互作用對(duì)析水率的影響Fig.5 Influence of each factor interaction on the syneresis rate

2.5.2 各因素交互作用對(duì)膨脹度的影響

各因素交互作用對(duì)膨脹度的影響見(jiàn)圖6。

圖6 各因素交互作用對(duì)膨脹度的影響Fig.6 Influence of each factor interaction on the expansion degree

由圖6a可知，酶解時(shí)間和加酶量的逐漸增加，小麥淀粉的膨脹度先急速升高再勻速下降，等高線的形狀趨近于橢圓形，膨脹度受時(shí)間和加酶量的交互效應(yīng)后變化顯著。由圖6b可知，加酶量和溫度的逐漸升高，膨脹度先急速上升再緩慢下降，等高線的形狀為橢圓形，說(shuō)明膨脹度受加酶量和溫度交互效應(yīng)后的變化極顯著。由圖6c可知，酶解溫度和時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，膨脹度勻速上升然后勻速下降，說(shuō)明膨脹度受酶解溫度和時(shí)間的交互效應(yīng)后的變化極顯著。

2.5.3 各因素交互作用對(duì)溶解度的影響

各因素交互作用對(duì)溶解度的影響見(jiàn)圖7。

圖7 各因素交互作用對(duì)溶解度的影響Fig.7 Influence of each factor interaction on the solubility

由圖7a可知，隨酶解時(shí)間和加酶量的逐漸增加，小麥淀粉的溶解度先上升然后緩慢的下降，等高線的形狀趨近于橢圓形，說(shuō)明溶解度受時(shí)間和加酶量的交互效應(yīng)后的變化顯著。由圖7b可知，加酶量和溫度的逐漸升高，溶解度急速上升然后下降，等高線的形狀為橢圓形，說(shuō)明溶解度受加酶量和溫度的交互效應(yīng)后的變化顯著。同理，由圖7c可知，酶解時(shí)間和溫度的作用也顯著。

2.6 優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得到小麥淀粉酶解的最優(yōu)工藝條件是：加酶量0.13%、酶解時(shí)間31.59 min、溫度52.84℃，在此條件下，小麥淀粉的析水率35.83%、膨脹度66.66%、溶解度17.31%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)，小麥淀粉酶解的最優(yōu)工藝條件調(diào)整為：加酶量0.13%、酶解溫度52.5℃、酶解時(shí)間30 min，在這個(gè)條件下，小麥淀粉的析水率、膨脹度和溶解度分別為35.8%、66.65%、17.34%，與預(yù)測(cè)值相近，由此表明該模型可靠。

3 結(jié)論

本研究比較分析了β-淀粉酶、G4淀粉酶的酶解作用對(duì)小麥淀粉抗老化的影響，兩種酶對(duì)小麥淀粉的抗老化指標(biāo)析水率、溶解度和膨脹度的影響均具有顯著性，能夠顯著提高淀粉的抗老化效果，兩者的作用效果相近無(wú)顯著差異，且復(fù)配后協(xié)同效果不顯著。選用具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)的β-淀粉酶得到小麥淀粉酶解的優(yōu)化工藝條件是：加酶量0.13%、酶解溫度52.5℃、酶解時(shí)間30 min，在此條件下，小麥淀粉的析水率、膨脹度和溶解度分別為35.80%、66.65%、17.34%，顯著改善了小麥淀粉的凍融穩(wěn)定性及膨潤(rùn)性，延緩其老化進(jìn)程。