吳暢　張繼君　趙夫娟　王俊普　文繼舫

【摘要】 目的：探討錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1及PMS2在結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）組織中的表達(dá)及其臨床病理意義。方法：應(yīng)用免疫組化PV法檢測結(jié)直腸癌組織（191例）中MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表達(dá)情況，將4種MMR蛋白中的1種及以上表達(dá)缺失判定為錯配修復(fù)基因缺陷（dMMR），全部陽性判定為錯配修復(fù)基因完整（pMMR），并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：（1）191例中pMMR組159例，MMR蛋白表達(dá)率83.2%，dMMR組32例，MMR蛋白缺失率為16.8%。MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表達(dá)缺失率分別為2.6%、2.6%、8.9%及14.7%;其中共同缺失表達(dá)類型為MSH2-MSH6、MLH1-PMS2及4種共同缺失者分別為4例（2.1%）、14例（7.3%）、2例（1.0%）。（2）CRC癌患者dMMR與pMMR在腫瘤部位、腫瘤直徑、分化程度等臨床病理特征方面比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而在性別、年齡、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯和神經(jīng)侵犯等方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：MMR蛋白與CRC臨床病理特征關(guān)系密切。MMR蛋白對預(yù)測CRC的惡性程度、臨床預(yù)后及發(fā)病機制方面可能有指導(dǎo)意義。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌; MSH2; MSH6; MLH1; PMS2; 免疫組織化學(xué)

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of mismatch repair protein（ MLH1，MSH2，MSH6 and PMS2）with clinicopathological features in colorectal cancer.Method：The expression of mismatch repair protein MLH1，MSH2，MSH6 and PMS2 were determined by immumohistochemistry in 191 cases of CRC.Deletion of one or more of the four MMR proteins were identified as mismatch repair gene defects（dMMR），and all positives were mismatch repair gene integrity（pMMR），their relationship with clinicopathological features was analyzed.Result：Negative staining of MMR proteins was found in 32 cases analyzed.The frequency of loss expression in MSH2，MSH6，MLH1and PMS2 was 2.6%，2.6%，8.9% and 14.7% respectively.Among them，double proteins absence were found in MSH2/MSH6 in 4 cases（2.1%）and MLH1/PMS2 in 14 cases（7.3%）.There 2 cases（1.0%）with 4 protein deletion.Patients with dMMR and pMMR in CRC had difference in tumor location，tumor diameter and degree of differentiation（P<0.05），but had no obvious difference in gender，age，invasion depth，lymph node metastasis，vascular invasion and neurological invasion（P>0.05）.Conclusion：There is a close relationship between MMR proteins and the clinicopathological characteristics of colorectal cancer.MMR proteins may be biological indicators for estimating malignant degree，clinical prognosis and pathogenesis mechanism of CRC.

【Key words】 Colorectal cancer; MSH2; MSH6; MLH1; PMS2; Immunohistochemistry

First-authors address：Shenzhen Sixth Peoples Hospital，Shenzhen 518052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.13.028

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，因其在癌癥進(jìn)展后預(yù)后不良導(dǎo)致的高死亡率，使其成為癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1-3]。全世界每年新發(fā)病例估計有140萬例，死亡病例為693 900例。在中國，CRC死亡率在惡性腫瘤死亡率中排名第五，嚴(yán)重危害人類健康[4]。據(jù)報道，多種危險因素導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生，如不健康的飲食，肥胖和吸煙。盡管早期CRC患者的5年生存率約為90%，但只有39%的病例在早期被診斷出來。當(dāng)其擴(kuò)散到遠(yuǎn)處器官時，5年生存率下降到12.5%[5]。臨床的挑戰(zhàn)是能夠在早期識別CRC患者，從而選擇更為合適的治療方案。因此深入了解參與CRC侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機制十分必要，具有重要的臨床意義。結(jié)直腸癌是一個復(fù)雜的，多步驟的過程，由多因素、多信號通路和多種基因突變導(dǎo)致。約15%的結(jié)腸癌是由DNA錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）基因缺陷所致。DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)的主要功能在于修復(fù)那些在DNA復(fù)制過程中逃脫DNA聚合酶即時校讀的錯配堿基，以維持基因組的穩(wěn)定性和避免細(xì)胞突變，從而間接抑制腫瘤的發(fā)生[6]。越來越多的研究表明人體不同部位的多種不同類型的腫瘤都可能與MMR的表達(dá)缺失密切相關(guān)。本研究采用免疫組化PV法檢測結(jié)直腸癌中MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表達(dá)情況，探討其與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系，為結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷提供客觀指標(biāo)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究中的所有標(biāo)本取自2017年1月-2018年11月在中南大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院確診并進(jìn)行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者191例。納入標(biāo)準(zhǔn)：按照2010版WHO標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)病理檢查確診為原發(fā)性結(jié)直腸癌;術(shù)前未進(jìn)行放化療;行腸癌根治術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：活檢標(biāo)本;免疫組化的資料不完整者。其中男114例，女77例;年齡35～81歲，平均60歲;結(jié)腸癌98例，直腸癌93例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者69例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者122例;分化程度：高分化腺癌18例，中分化腺癌147例，低分化腺癌26例;腫瘤直徑：<5 cm者109例，≥5 cm者82例;浸潤深度：T1 + T2共43例，T3 + T4共148例;有脈管侵犯者34例，無脈管侵犯者157例;有神經(jīng)侵犯者23例，無神經(jīng)侵犯者168例。該研究已經(jīng)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者知情同意。所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診。

1.2 方法 送檢組織經(jīng)4%中性甲醛液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3 μm厚度切片，HE染色，光鏡觀察。選取腫瘤與正常組織同時存在的蠟塊，4 μm厚度切片行免疫組化，采用Envision法，一抗為MSH2、MSH6、MLH1及PMS2，抗體及所用免疫組化試劑均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，操作步驟按照試劑說明書進(jìn)行。以上操作均用已知陽性片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照，每例都有HE切片做對照觀察。

1.3 結(jié)果判定 陽性結(jié)果明確，陽性信號的位置正確且染色特征正確。MLH1、MSH2、MSH6及PMS2均定位于細(xì)胞核。對照組織即腫瘤周圍的正常上皮細(xì)胞、腫瘤內(nèi)浸潤的淋巴細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞核著色，可作為內(nèi)對照[7]。根據(jù)文獻(xiàn)[3]，陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：MMR蛋白在細(xì)胞核明確著色表達(dá)判定為陽性，與核染色強弱以及陽性細(xì)胞彌漫或局灶分布無關(guān);細(xì)胞核不著色判斷為陰性。將4種MMR蛋白中的1種及以上表達(dá)缺失判定為錯配修復(fù)基因缺陷組（deficent Mismatch Repair，dMMR），全部陽性判定為錯配修復(fù)基因完整組（proficient Mismatch Repair，pMMR）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用率（%）表示，比較采用檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMR蛋白表達(dá)情況 4種MMR蛋白表達(dá)均定位于腫瘤細(xì)胞核，191例CRC中MMR蛋白陽性者（pMMR組）159例（83.2%），表達(dá)缺失者（dMMR組）32例（16.8%），其中MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表達(dá)缺失者分別為5例（2.6%）、5例（2.6%）、17例（8.9%）及28例（14.7%）;MSH2與MSH6共同缺失表達(dá)者4例（2.1%），MLH1與PMS2共同缺失表達(dá)者14例（7.3%）;4種蛋白共同缺失者2例（1.0%）。

2.2 MMR蛋白表達(dá)與CRC臨床病理特征的關(guān)系 dMMR組與pMMR組相比，在腫瘤部位、腫瘤直徑、分化程度等臨床病理特征方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表現(xiàn)為在dMMR組腫瘤直徑更大，發(fā)生結(jié)腸者所占比例多，分化程度更低。而在性別、年齡、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯和神經(jīng)侵犯等方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

CRC是消化道中最常發(fā)生的惡性腫瘤之一，對全世界眾多患者的健康構(gòu)成了巨大威脅[8]。CRC患者直到癌癥晚期都沒有明顯的臨床癥狀是該疾病最常見的標(biāo)志之一，導(dǎo)致預(yù)后不良和高死亡率[9]。雖然在早期能夠通過手術(shù)，化學(xué)療法或者放射療法等方式進(jìn)行治療，但僅有少數(shù)CRC病例可以在早期獲得確診。腫瘤具有快速進(jìn)展和預(yù)后不良的特點，這也是影響CRC治療的主要問題[10]。

臨床上根據(jù)結(jié)直腸癌的發(fā)病特點將其分為遺傳性與散發(fā)性兩種，散發(fā)性結(jié)直腸癌是最常見的CRC類型。CRC中存在幾種分子變化，例如染色體不穩(wěn)定性（CIN），微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）和CpG島甲基化表型（CIMP）[11]。微衛(wèi)星是分布在基因組編碼區(qū)和非編碼區(qū)的DNA序列的短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），由于它們的重復(fù)結(jié)構(gòu)而易于導(dǎo)致高突變率。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）是一種從DNA錯配修復(fù)（MMR）系統(tǒng)中興起的分子表型。DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)糾正了DNA復(fù)制和重組過程中產(chǎn)生的缺失，插入和堿基錯配，這些錯誤已經(jīng)逃脫了校對過程[12-14]。MMR的缺陷導(dǎo)致全基因組不穩(wěn)定，特別是在簡單的重復(fù)序列中（稱為MSI）。很多研究指出在結(jié)腸，胃，子宮內(nèi)膜和大多數(shù)其他散發(fā)性癌癥中存在MSI。確定CRC中MSI的狀態(tài)具有預(yù)后和治療結(jié)果。此外，MSI在臨床上可用于檢測因MMR缺乏引起的種系缺陷的患者，并用于腫瘤診斷和分類[3，11]。

目前免疫組織化學(xué)方法已被廣泛應(yīng)用，且報道證實檢測MMR基因的可靠性，因此應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測MMR基因被醫(yī)院及科研機構(gòu)所采用[15]。錯配修復(fù)蛋白包括MutS和MutL兩大家族，其中MutS主要包括MSH2、MSH3和MSH6等，MutL主要包括MLH1、MLH3、PMS1和PMS2等。研究表明具有種系突變的最常見MMR基因是MSH2，MLH1，PMS2和MSH6，擔(dān)負(fù)著對錯配位點識別和切除的主要功能，保持基因的穩(wěn)定性。一種或多種錯配修復(fù)蛋白的功能缺失可引起MSI，因此，檢測錯配修復(fù)蛋白缺失情況可間接反應(yīng)腫瘤的MSI狀態(tài)[16-17]。國家衛(wèi)生和計劃生育委員會頒布的《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范》（2017年版）提出確定為結(jié)直腸癌時，推薦檢測錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）蛋白（MSH2，MSH6，MLH1，PMS2）表達(dá)情況。臨床試驗有可能在現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)治療基礎(chǔ)上給患者帶來更多獲益（例如：dMMR或MSI-H患者有可能從免疫治療獲益）[18]。

本研究結(jié)果顯示，MSH2缺失者占2.6%，MSH6表達(dá)缺失占2.6%，MLH1缺失者占8.9%，PMS2缺失者占14.7%，提示這4種蛋白的突變情況與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的相關(guān)性。而于靜等[19-20]研究結(jié)果表明不同地區(qū)的散發(fā)性結(jié)直腸癌患者各缺失蛋白所占的比例有所不同，并且發(fā)生突變的基因也有所不同。MSI表達(dá)情況在腫瘤部位、腫瘤直徑、分化程度等臨床病理特征方面存在差異（P<0.05）。

綜上所述，錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）蛋白（MSH2，MSH6，MLH1，PMS2）在結(jié)直腸癌的臨床病理診斷中有重要參考價值，通過檢測MMR蛋白表達(dá)情況，可以初步判斷錯配修復(fù)基因是否存在缺失，并且能夠提示缺失的錯配修復(fù)蛋白類型，且錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）蛋白（MSH2，MSH6，MLH1，PMS2）與腫瘤部位、腫瘤直徑、分化程度等臨床病理特征方面有一定的關(guān)系，從而為患者的預(yù)后判斷提供一定的參考依據(jù)。但由于本研究尚不屬于大樣本，不具有廣泛的代表性，因此具有一定的局限性。有待于更多更大更全面的相關(guān)研究，對本研究結(jié)果加以驗證或進(jìn)行補充。

參考文獻(xiàn)

[1] Bopanna S，Ananthakrishnan A N，Kedia S，et al.Risk of colorectal cancer in Asian patients with ulcerative colitis：a systematic review and meta-analysis[J].The Lancet Gastroenterology & Hepatology，2017，2（4）：269-276.

[2] Miao Z，Deng X，Shuai P，et al.Upregulation of SOX18 in colorectal cancer cells promotes proliferation and correlates with colorectal cancer risk[J].Onco Targets Ther，2018，11：8481-8490.

[3] Sameer A S，Nissar S，F(xiàn)atima K.Mismatch repair pathway：molecules，functions，and role in colorectal carcinogenesis[J].Eur J Cancer Prev，2014，23（4）：246-257.

[4] Yang J，Xiao J，F(xiàn)eng J，et al.One-year Unplanned Readmission After Colorectal Cancer Surgery in Western China[J].J Invest Surg，2018：1-5.

[5] Fang Y，Liang X，Xu J，et al.miR-424 targets AKT3 and PSAT1 and has a tumor-suppressive role in human colorectal cancer[J].Cancer Manag Res，2018，10：6537-6547.

[6] Roberts M E，Jackson S A，Susswein L R，et al.MSH6 and PMS2 germ-line pathogenic variants implicated in Lynch syndrome are associated with breast cancer[J].Genet Med，2018，20（10）：1167-1174.

[7]晉薇，馬亞琪，王昀，等.錯配修復(fù)基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床意義[J].診斷病理學(xué)雜志，2018，25（5）：335-339.

[8] Wang W，He Y，Rui J，et al.miR-410 acts as an oncogene in colorectal cancer cells by targeting dickkopf-related protein 1 via the Wnt/β-catenin signaling pathway[J].Oncol Lett，2019，17（1）：807-814.

[9] Niu W，Wang G，F(xiàn)eng J，et al.Correlation between microsatellite instability and RAS gene mutation and stage Ⅲ colorectal cancer[J].Oncol Lett，2019，17（1）：332-338.

[10] Behrouz Sharif S，Hashemzadeh S，Mousavi Ardehaie R，et al.

Detection of aberrant methylated SEPT9 and NTRK3 genes in sporadic colorectal cancer patients as a potential diagnostic biomarker[J].Oncol Lett，2016，12（6）：5335-5343.

[11] Nouri Nojadeh J，Hashemzadeh S，Samadi Kafil H，et al.

Evaluation of microsatellite instability in tumor and tumor marginal samples of sporadic colorectal cancer using mononucleotide markers[J].EXCLI J，2018，17：945-951.

[12]徐晉珩，劉麗云，田莉，等.散發(fā)性結(jié)直腸癌癌組織中錯配修復(fù)蛋白和nm23蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[J].東南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2018，37（4）：642-648.

[13] Park J H，Powell A G，Roxburgh C S，et al.Mismatch repair status in patients with primary operable colorectal cancer：associations with the local and systemic tumour environment[J].Br J Cancer，2016，114（5）：562-570.

[14] Flores-Rozas H，Jaafar L，Xia L.The Role of DNA Mismatch Repair and Recombination in the Processing of DNA Alkylating Damage in Living Yeast Cells[J].Adv Biosci Biotechnol，2015，6（6）：408-418.

[15] Amira A T，Mouna T，Ahlem B，et al.Immunohistochemical expression pattern of MMR protein can specifically identify patients with colorectal cancer microsatellite instability[J].Tumour Biol，2014，35（7）：6283-6291.

[16]晉龍，眭玉霞，王麗萍，等.結(jié)直腸癌錯配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、MSH6及PMS2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[J].診斷病理學(xué)雜志，2017，24（11）：813-817.

[17] Rodriges Blanko E，Kadyrova L Y，Kadyrov F A.DNA Mismatch Repair Interacts with CAF-1- and ASF1A-H3-H4-dependent Histone（H3-H4）2 Tetramer Deposition[J].J Biol Chem，2016，291（17）：9203-9217.

[18]顧晉，汪建平.中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2017年版）[J/OL].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2018，12（1）：1089-1103.

[19]于靜，張曉瑩，趙峰，等.新疆維吾爾族及漢族散發(fā)性結(jié)直腸癌中hMLH-1、hM-SH-2差異性表達(dá)及臨床意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2015，31（10）：1085-1088，1094.

[20] Buchanan D D，Rosty C，Clendenning M，et al.Clinical problems of colorectal cancer and endometrial cancer cases with unknown cause of tumor mismatch repair deficiency（suspected Lynch syndrome）[J].Appl Clin Genet，2014，7：183-193.

（收稿日期：2019-01-09） （本文編輯：周亞杰）