不同預(yù)處理方法對煙桿酶解產(chǎn)糖和結(jié)構(gòu)特征的影響

宋麗麗 張志平 王光路 楊旭 張靖楠

關(guān)鍵詞：

煙桿;酶解產(chǎn)糖;預(yù)處理;結(jié)構(gòu)特征

摘要：以煙草加工副產(chǎn)物煙桿為原料，將酸處理、堿處理和微波處理對煙桿酶解產(chǎn)糖的影響進(jìn)行比較，并分析處理前后煙桿組分和微觀結(jié)構(gòu)的變化.結(jié)果表明，3種預(yù)處理方法中，堿處理對煙桿轉(zhuǎn)化效率提升的作用較為顯著，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaOH溶液于75 ℃處理煙桿120 min，每g煙桿酶解液中葡萄糖質(zhì)量為334.69 mg，較對照樣品提高了118.37%.組分分析表明，堿處理對煙桿木質(zhì)素的降解較為明顯，降解率為46.45%.堿處理不僅破壞了煙桿木質(zhì)素苯環(huán)骨架，還對苯環(huán)側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行了改性，造成木質(zhì)素大分子結(jié)構(gòu)解體，煙桿酶解抗性屏障作用降低，從而提高了煙桿的轉(zhuǎn)化效率.堿處理并未改變煙桿纖維素結(jié)晶度，而微波處理和酸處理導(dǎo)致的結(jié)晶度升高反而會對提升煙桿酶解效率產(chǎn)生負(fù)面影響.

Abstract：The effects of acid treatment， alkali treatment and microwave treatment on the enzymatic hydrolysis of tobacco stalks were studied by using tobacco processing by＼|product tobacco rods as raw materials， and the changes of composition and microstructure of tobacco stalks before and after treatment were analyzed. The results showed that the alkali treatment had a significant effect on the conversion efficiency of tobacco stalks in the three pretreatment methods. The tobacco stalks were treated with a mass fraction of 1% NaOH solution at 75 °C for 120 min， and the glucose content in the hydrolysate was 334.69 mg/g tobacco stalks increased by 118.37% compared to the control sample. The composition analysis showed that the degradation of tobacco lignin by alkali treatment was more obvious， and the degradation rate was 46.45%. Alkali treatment not only destroyed the tobacco lignin benzene ring skeleton， but also modified the benzene ring side chain group， resulting in the disintegration of the lignin macromolecular structure， and the tobacco stalks enzymatic resistance barrier function was reduced， thereby improving the conversion efficiency of tobacco stalks. Alkali treatment did not change the crystallinity of tobacco stalks cellulose， and the increase in crystallinity caused by microwave and acid treatment would adversely affected the efficiency of enzymatic hydrolysis of tobacco stalks.

0 引言

我國煙草資源豐富，煙草的種植量和生產(chǎn)量都居世界首位，而煙桿作為煙草種植加工的副產(chǎn)物，絕大部分都未被合理地利用[1]，這不僅造成煙草秸稈資源的浪費(fèi)，而且秸桿焚燒也破壞了生態(tài)環(huán)境.如何變廢為寶，充分利用煙桿，發(fā)揮其潛在資源價值，是當(dāng)前煙草行業(yè)急需解決的問題.煙桿的成分主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，其中纖維素含量為38.0%～45.0%[2].目前，煙桿類資源主要的利用途徑有提取重要化合物、制備高附加值產(chǎn)品、制備生物質(zhì)燃料等.近年來，環(huán)境友好的生物煉制技術(shù)逐漸成為木質(zhì)纖維素類廢棄物資源化利用的發(fā)展趨勢[3-4].該技術(shù)通常利用纖維素酶和微生物將木屑、秸稈等廢棄物轉(zhuǎn)化為糖、乙醇、乳酸等生物基產(chǎn)品[5-6].糖和乙醇是煙草加工過程中的兩類重要輔料，通常應(yīng)用于美拉德反應(yīng)、香料提取等.因此，如果利用生物煉制技術(shù)將煙桿合理高效轉(zhuǎn)化，不僅有助于實(shí)現(xiàn)廢棄物資源的增值化利用，又能為煙草企業(yè)提供廉價的輔料來源，這對提高煙草行業(yè)資源化循環(huán)利用水平具有重要的意義.生物煉制技術(shù)將為煙桿廢棄物的資源化利用、促進(jìn)煙草行業(yè)的綠色生產(chǎn)提供一條新的途徑.

高效利用與轉(zhuǎn)化纖維素生產(chǎn)葡萄糖等單糖是生物煉制產(chǎn)糖的重要方式.天然木質(zhì)纖維素由于具有復(fù)雜的物理結(jié)構(gòu)及各組分間的特殊化學(xué)連接方式，在其生物轉(zhuǎn)化過程中易產(chǎn)生極高的抗性，使得其利用效率較低.因此必須采用一定的預(yù)處理手段以降低木質(zhì)纖維素的酶解抗性屏障，增加原料的多孔性，降低纖維素的結(jié)晶度，從而釋放出更多可利用的底物[7].常用的預(yù)處理方法包括物理預(yù)處理、化學(xué)預(yù)處理、理化結(jié)合及生物預(yù)處理等[8-11].不同的預(yù)處理方法對生物質(zhì)改性的方式不同，原料的轉(zhuǎn)化效率也不同.因此，選擇適當(dāng)?shù)念A(yù)處理方法將有助于提高煙桿生物轉(zhuǎn)化效率，實(shí)現(xiàn)煙桿的高效生物煉制.

本研究擬通過比較煙桿和其他農(nóng)林廢棄物的組分差異，探討煙桿生物煉制的可行性，分別研究酸、堿、微波3種預(yù)處理方式對煙桿酶解產(chǎn)糖的影響，并探究不同預(yù)處理方式對煙桿結(jié)構(gòu)特征的影響，從而為高效的煙桿木質(zhì)纖維素廢棄物生物轉(zhuǎn)化提供參考.

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

主要材料：煙桿，來自河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，采收于2017年;稻草秸稈、玉米秸稈、小麥秸稈，來源于河南信陽.將采收的各類秸稈自然曬干后，粉碎過20目篩，保存?zhèn)溆?纖維素酶，購買于Sigma 公司，經(jīng)測定其總纖維素酶酶活為100 FPU·g-1.

主要試劑：NaOH，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%的濃H2SO4，冰醋酸，醋酸鈉，3，5-二硝基水楊酸，酒石酸鉀鈉，無水亞硫酸鈉，苯酚等，均購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司.以上試劑均為分析純.

實(shí)驗(yàn)儀器： TENSOR 27型傅里葉紅外光譜分析儀、D8ADVANCE型 X射線衍射儀，德國Bruker公司產(chǎn);T6 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn);101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn);HH-S型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療器械有限公司產(chǎn);EG720FA4-NR型微波爐，美的集團(tuán)產(chǎn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 煙桿與秸稈樣品組成成分測定

天然木質(zhì)纖維素主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大組分，不同種類木質(zhì)纖維素三組分含量差異較大.其中纖維素是由β-1，4-糖苷鍵連接而成的葡聚糖大分子，是生物煉制中重要的糖平臺底物來源，纖維素含量越高，所獲得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物越多[12].煙桿中可利用底物含量的多少是決定其是否適合作為生物煉制原料的關(guān)鍵.分別稱取適量煙桿、玉米秸稈、麥稈和稻桿樣品，利用美國可再生能源實(shí)驗(yàn)室制定的標(biāo)準(zhǔn)方法測定各類秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量[13].

1.2.2 預(yù)處理方法

1）微波處理：稱取10 g煙桿，按照m（煙桿）V（水）=12攪拌均勻， 300 W微波分別處理1 min，3 min，5 min，60 ℃烘干至恒重，備用.

2）NaOH處理：稱取10 g煙桿，適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的NaOH，按m（煙桿）V（NaOH）=115的比例于75 ℃分別處理15 min，30 min，60 min 和120 min，反應(yīng)完畢將樣品水洗至中性，煙桿殘渣于60 ℃烘干后備用.

3）稀H2SO4處理：以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的H2SO4溶液處理，方法同NaOH處理.

1.2.3 酶解糖化

將用酸處理、堿處理和微波處理后的煙桿以m（煙桿）V（醋酸-醋酸鈉緩沖溶液）=150的固液比置于50 mmol/L，pH=4.8，纖維素酶負(fù)荷為30 FPU/g的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中， 50 ℃反應(yīng) 72 h，離心取上清液，利用高效液相色譜（HPLC）測樣品中葡萄糖的含量.色譜條件：Bio＼|Rad HPX-87C色譜柱，示差折光檢測器（RID），柱溫75 ℃，檢測器溫度35 ℃，流動相為超純水，流速為0.6 mL/min，樣品進(jìn)樣量為10 μL.

1.2.4 計算方法

1.2.5 預(yù)處理煙桿微觀結(jié)構(gòu)分析方法

1.2.5.1 紅外光譜分析（FTIR） 木質(zhì)素大分子結(jié)構(gòu)中含有多種不同價鍵和功能基團(tuán)，在紅外圖譜上可顯示有特征的“指紋吸收峰”，利用紅外光譜技術(shù)可以分析煙桿結(jié)構(gòu)中羰基、羥基、甲氧基、苯環(huán)骨架和CC雙鍵的變化情況.

用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行紅外光譜分析.將樣品和KBr混合研磨，10 MPa保持3～4 min，制成均勻透明膜片測樣.檢測條件為：譜區(qū)范圍400～4000 cm-1;采樣速率80張譜/s;分辨率 0.4 cm-1，得到經(jīng)不同預(yù)處理后煙稈的FTIR譜圖.

1.2.5.2 X-射線衍射分析（XRD） 纖維素高度有序的結(jié)構(gòu)是影響生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要因素之一，其內(nèi)部或相鄰纖維素間較易形成氫鍵，使纖維素內(nèi)部鏈狀結(jié)構(gòu)及各條鏈之間形成高度結(jié)晶化結(jié)構(gòu)[14].結(jié)晶結(jié)構(gòu)是纖維素聚合物顯示出剛性和高度水不溶性的關(guān)鍵因素，破壞結(jié)晶結(jié)構(gòu)，釋放纖維素，是提高酶水解的重要步驟.因此，結(jié)晶度是影響酶解糖化效率的要素之一.

用X射線衍射儀對樣品進(jìn)行結(jié)晶度分析.樣品制樣后放至掃描儀中，設(shè)置 X光管為Cu靶，電壓40 kV，電流30 mA，掃描衍射角2θ為10°～50°，掃描速率為0.02 mm/s，得到衍射圖譜.結(jié)晶度指數(shù)CrI=I002-I001I002×100%，I002為結(jié)晶區(qū)的峰值強(qiáng)度，I001為非晶區(qū)的峰值強(qiáng)度.

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)煙桿組成成分分析

煙桿與其他秸稈樣品的組成成分見表1.由表1可知，煙桿的組成成分與麥稈、稻桿和玉米秸稈相似，即主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，另外還含有少量的灰分.煙桿糖組分（纖維素和半纖維素）的含量為54.25%，其中纖維素的主要組成成分是葡聚糖，含量為38.39%，與稻桿接近，高于玉米秸稈和麥稈，而半纖維素的主要組成成分為木聚糖，含量僅為15.86%，顯著低于其他秸稈;木質(zhì)素含量為18.83%，接近于麥稈中木質(zhì)素的含量.在木質(zhì)纖維素大分子中，木質(zhì)素和半纖維素通常與纖維素交聯(lián)在一起，構(gòu)成致密的結(jié)構(gòu)，阻礙纖維素酶對纖維素底物的吸附，從而影響生物轉(zhuǎn)化的效率[15-16].因此，木質(zhì)素或半纖維素含量越低的原料生物轉(zhuǎn)化越容易.煙桿中有較高的纖維素含量和較低的半纖維素含量，具有較大的糖平臺轉(zhuǎn)化優(yōu)勢，是一種較有潛力的生物煉制原料.

2.2 不同預(yù)處理方式對煙桿酶解產(chǎn)糖的影響

經(jīng)不同預(yù)處理后的煙桿酶解液中葡萄糖的含量如圖1所示.由圖1可知，微波處理1 min和3 min時，葡萄糖產(chǎn)量都有不同程度的下降，處理5 min時，葡萄糖產(chǎn)量上升了12.25%.整體來講，微波處理的效果并不明顯.這與岳建芝等[17]研究微波輻射處理高粱秸稈對酶水解的影響得出的單一微波處理對酶解的促進(jìn)作用不明顯的結(jié)論一致.

隨著酸預(yù)處理時間的延長，煙桿酶解液中葡萄糖的生成量逐漸增加，但整體而言葡萄糖的產(chǎn)量較原料都有一定程度的下降.其原因是酸處理主要溶出秸稈中的半纖維素，而酸濃度、處理時間、處理溫度等對秸稈預(yù)處理效果均有影響[5].I.Dogaris等[18]利用稀酸對高粱和甘蔗渣進(jìn)行預(yù)處理（溫度210 ℃，時間 10 min）能夠?qū)⒏吡缓透收嵩母甙肜w維素分解，但也會產(chǎn)生低抑制劑，影響酸的水解效率.本實(shí)驗(yàn)采用的酸處理溫度為75 ℃，較溫和，故處理效果較差.

堿預(yù)處理中的煙桿，當(dāng)反應(yīng)時間為15 min時，每g煙桿葡萄糖的質(zhì)量為114.19 mg，較原料降低了25.50%.隨著處理時間的增加，每g煙桿樣品中葡萄糖的質(zhì)量分別為261.26 mg，281.33 mg和334.69 mg，較對照樣品分別提高了70.46%，83.55%和118.37%.堿處理效果隨著處理時間的延長而提高，可能是因?yàn)镹aOH逐漸突破煙桿的表面屏障，與內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生充分反應(yīng)使木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)裂解，降低了木質(zhì)纖維素的酶解抗性，提高了煙桿的水解效率.

與酸預(yù)處理和單獨(dú)微波預(yù)處理相比，堿預(yù)處理對煙桿轉(zhuǎn)化效率的提升更加顯著.研究表明，酸預(yù)處理通過水解木質(zhì)纖維素中的半纖維素，破壞木質(zhì)纖維素的致密結(jié)構(gòu)并增加其多孔性，從而增強(qiáng)酶轉(zhuǎn)化效率[19];微波預(yù)處理可以降解部分木質(zhì)素和纖維素，改變超分子結(jié)構(gòu)，從而增加纖維素對酶的可及度.但微波預(yù)處理通常要與其他化學(xué)預(yù)處理聯(lián)合使用，其效果才較為明顯[17].堿處理主要是通過堿的去木質(zhì)化作用去除部分木質(zhì)素，并斷裂木質(zhì)素和半纖維素之間的連鍵，同時部分半纖維素與堿發(fā)生“剝皮反應(yīng)”，溶解在堿液中，從而增強(qiáng)纖維素酶和纖維素底物的親和力[7，20].

2.3 預(yù)處理后煙桿各組分的變化

分別測定微波處理5 min，堿處理120 min，酸處理120 min后煙桿中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率，結(jié)果如表2所示.由表2可知，經(jīng)預(yù)處理后，煙桿中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量都出現(xiàn)不同程度的變化.微波處理后3種成分的含量變化都不大且呈現(xiàn)同步降解，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素分別降解了9.42%，5.68%和7.40%，說明微波處理還不足以完全破壞木質(zhì)纖維素的復(fù)雜結(jié)構(gòu).酸處理主要是降解了煙桿中的半纖維素，半纖維素組分含量降低了31.45%，纖維素和木質(zhì)素分別降解了6.33%和9.72%.這與文新亞等[21]稀酸處理可有效去除半纖維素而對于木質(zhì)素的脫除效果較差的研究結(jié)論一致.酸處理通過對煙桿中纖維素與半纖維素之間的氫鍵發(fā)生作用，使其斷裂，將半纖維素釋放出來，并溶解部分木質(zhì)素.經(jīng)堿處理的樣品中木質(zhì)素的含量明顯下降，說明在堿處理過程中，NaOH主要對木質(zhì)素起作用，使木質(zhì)素與碳水化合物的結(jié)構(gòu)鏈分離，破壞了木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，而木質(zhì)素的降解是提升煙桿酶解轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵.

本研究中，微波處理對煙桿組分的降解作用不顯著，而酸處理主要脫除了煙桿中的半纖維素，盡管半纖維素和木質(zhì)素對木質(zhì)纖維素的生物煉制都會產(chǎn)生阻礙作用，但由于半纖維素的水解，往往導(dǎo)致處理后基質(zhì)木質(zhì)素含量顯著上升.對于煙桿而言，木質(zhì)素的選擇性降解對煙桿酶解糖化的影響較半纖維素更加顯著.因此，堿處理較酸處理和微波處理更適合增強(qiáng)煙桿的糖平臺轉(zhuǎn)化.

2.4 預(yù)處理煙桿微觀結(jié)構(gòu)分析

煙桿在預(yù)處理過程中除了化學(xué)組分含量會發(fā)生變化外，微觀結(jié)構(gòu)也會發(fā)生改變，從而影響酶解糖化效率.下面針對微波處理5 min，堿處理120 min，酸處理120 min 3種預(yù)處理方式對煙桿微觀結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)行分析.

2.4.1 紅外光譜分析結(jié)果

經(jīng)不同預(yù)處理的煙桿其紅外圖譜如圖2所示.由圖2可知，經(jīng)堿處理后，煙桿在1735 cm-1處特征吸收峰完全消失，1735 cm-1處吸收峰代表的是CO的伸縮振動，關(guān)系到半纖維素與木質(zhì)素之間的連接[22]，這一特征峰的完全消失說明半纖維素CO結(jié)構(gòu)被破壞，同時半纖維素與木質(zhì)素之間的的復(fù)合結(jié)構(gòu)在堿處理的條件下解聚.1510 cm-1處吸收峰代表木質(zhì)素苯環(huán)CC 雙鍵振動形成的吸收峰[23]，此處吸收峰強(qiáng)度減弱，表明在經(jīng)過NaOH處理后，煙桿木質(zhì)素中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，木質(zhì)素大分子空間結(jié)構(gòu)被打開，有利于木質(zhì)素的降解.1249 cm-1處吸收峰代表的是木質(zhì)素中紫丁香基芳環(huán)與甲氧基鍵合的C—O—C鍵發(fā)生不對稱伸縮振動[24]，與原料相比，處理后樣品的峰強(qiáng)度顯著降低，說明NaOH對木質(zhì)素中紫丁香基苯環(huán)和側(cè)鏈基團(tuán)（如CO，C—O—C）均有一定程度的影響.

經(jīng)微波處理后，煙桿樣品的紅外圖譜峰型并未明顯改變，僅在1510 cm-1（木質(zhì)素苯環(huán)特征吸收峰）和1161 cm-1（纖維素、半纖維素C—O—C結(jié)構(gòu)[25]）處吸收峰強(qiáng)度有輕微的降低，即微波處理僅破壞少量木質(zhì)素、纖維素和半纖維素結(jié)構(gòu)，對秸稈復(fù)雜大分子結(jié)構(gòu)并未有顯著的改性作用.煙桿樣品經(jīng)酸處理后，在1735 cm-1處木聚糖的CO的伸縮振動峰降低，表明酸處理降解了煙桿中的半纖維素;1630 cm-1處吸收峰是木質(zhì)素中與芳香環(huán)相連的共軛CO伸縮振動峰[25]，經(jīng)酸處理后這一吸收峰強(qiáng)度增加，說明苯環(huán)的側(cè)鏈基團(tuán)修飾生成了羰基結(jié)構(gòu).C.L.Li等[26]的研究結(jié)論也表明酸處理對苯環(huán)結(jié)構(gòu)單元并沒有明顯的改變，酸處理僅降解半纖維素并對煙桿木質(zhì)素的苯環(huán)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾.

2.4.2 X-射線衍射分析結(jié)果

不同預(yù)處理后煙桿結(jié)晶度有不同的變化：經(jīng)酸處理后的煙桿結(jié)晶度為36.78%，比原料結(jié)晶度（34.54%）升高了6.49%，H2SO4能斷裂纖維素分子中的β-1， 4-糖苷鍵，迅速降低纖維素聚合度，處理后纖維素相對結(jié)晶度增加可能是因?yàn)槔w維素分子的無定形區(qū)遭到破壞，使之發(fā)生重取向或呈更為有序的狀態(tài)[27];經(jīng)過微波處理5 min后，結(jié)晶度為35.44%，與原料相比，提高了2.61%.經(jīng)堿處理后煙桿的結(jié)晶度為34.77%，并未有顯著的變化，僅比原料提高了0.67%.L.Q.Chu等[28]研究表明，NaOH脫除木質(zhì)素的效果與預(yù)處理時間成正比，而纖維素則無明顯變化，高濃度的NaOH預(yù)處理才會導(dǎo)致纖維素晶型的改變.本研究中堿處理并未改變煙桿纖維素結(jié)晶度，而微波處理和酸處理導(dǎo)致的結(jié)晶度升高反而會對提升煙桿酶解效率產(chǎn)生負(fù)面影響.

3 結(jié)論

本文通過比較煙桿和其他秸稈的組分差異，探討了煙桿生物煉制的可行性，并對比酸處理、堿處理和微波處理對煙桿酶解產(chǎn)糖的影響，確定了最適合煙桿的預(yù)處理方法，進(jìn)一步分析處理前后煙桿組分和微觀結(jié)構(gòu)變化，確定了與煙桿轉(zhuǎn)化效率密切相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)因素，主要結(jié)論如下：

1）實(shí)驗(yàn)煙桿的組成成分類似于麥稈、稻桿和玉米秸稈等農(nóng)作物秸稈，含有較多的纖維素多糖組分，適合作為生物煉制的原料.

2）堿預(yù)處理對煙桿生物轉(zhuǎn)化效率的提升較酸處理和微波處理更為顯著，適合作為煙桿生物煉制的預(yù)處理方式.經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的NaOH溶液于75 ℃處理120 min后，每g煙桿酶解液中的葡萄糖質(zhì)量可達(dá)334.69 mg，較未處理煙桿提高118.37%.

3）堿處理主要降解煙桿中的木質(zhì)素，降解率達(dá)到46.45%;堿處理在破壞煙桿木質(zhì)素苯環(huán)骨架的同時，對苯環(huán)的側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾，以破壞木質(zhì)素與半纖維素之間的鍵接，達(dá)到了降低煙桿酶解抗性的目的，堿處理并未改變煙桿纖維素結(jié)晶度，而微波處理和酸處理導(dǎo)致的結(jié)晶度升高反而會對提升煙桿酶解效率產(chǎn)生負(fù)面影響.

本研究給出的堿處理技術(shù)提高了煙桿的生物轉(zhuǎn)化效率，適合于高效的煙桿生物煉制過程，有助于煙草廢棄物的資源化利用，為促進(jìn)煙草行業(yè)的綠色生產(chǎn)水平提供新的途徑，為獲得高效的煙草廢棄物生物轉(zhuǎn)化工藝奠定基礎(chǔ).

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