文/張必良

脫氧核糖核酸（DNA）是一種遺傳物質(zhì)，就像電腦中的硬盤，貯存著生物的全部遺傳信息，而核糖核酸（RNA）是基因的轉(zhuǎn)錄體，像電腦中的軟件。近年來，核糖核酸（RNA）在細(xì)胞中的廣泛性功能得到了重新認(rèn)識，核酸領(lǐng)域的新概念和前沿技術(shù)不斷涌現(xiàn)，比如靶向基因修飾及改造技術(shù)、信使核糖核酸（mRNA）介導(dǎo)的基因治療技術(shù)、非編碼RNA靶向基因調(diào)控技術(shù)等前沿的快速發(fā)展，使核酸技術(shù)成為現(xiàn)代生物技術(shù)的熱點，一個新興的核酸生物產(chǎn)業(yè)已經(jīng)出現(xiàn)。

核酸藥物一般指化學(xué)合成的寡核苷酸藥物（化學(xué)藥），包括基因沉默、微小核糖核酸、反義寡核苷酸、免疫佐劑寡核苷酸以及適配體等；和生物合成的核糖核酸藥物（生物藥），包括mRNA治療、DNA/RNA疫苗、基因編輯及其他核糖核酸。

核酸藥物可以達(dá)到傳統(tǒng)藥物無法替代的效果，例如抗體只能作用于細(xì)胞表面，而核酸藥物與小分子藥物一樣不僅可以在細(xì)胞外發(fā)揮作用，也可以在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，甚至可以在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，并具有精確的靶向性。人類面臨的7000多種疾病，其中6000多種遺傳性罕見病是遺傳密碼DNA或轉(zhuǎn)錄本RNA出了問題，在臨床上幾乎無藥可治，核酸藥物對這種單基因疾病非常有優(yōu)勢。在精準(zhǔn)醫(yī)療概念普及的大時代下，理論上，由基因差異或基因表達(dá)異常引起的疾病，都可利用核酸治療技術(shù)對其進(jìn)行個性化開發(fā)。

基因沉默技術(shù)首個RNAi治療藥物在美上市

RNAi（RNA interference）即RNA干擾，又叫“基因沉默”，是指雙鏈RNA（doublestranded RNA，dsRNA）使mRNA發(fā)生高效特異性降解或翻譯受阻而導(dǎo)致的基因表達(dá)沉默現(xiàn)象。

雖然早在20世紀(jì)90年代就發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象，但當(dāng)時并不清楚其發(fā)生功能的機(jī)制。直到1998年，安德魯·法爾克（Andrew Fire）和克雷格·梅洛（Craig Mello）兩位教授在秀麗線蟲（C.elegans）的研究中發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA可特異地使信使核糖核酸（mRNA）降解，從而調(diào)控蛋白表達(dá)，闡明了從特定基因降解mRNA的方式，并正式命名為RNAi。該研究揭開了基因功能研究和非編碼RNA研究的序幕。隨后研究發(fā)現(xiàn)RNAi是通過小雙鏈RNA（small interferencing dsRNA,siRNA）發(fā)揮基因沉默作用，之后RNAi技術(shù)很快被用于后基因組時代確定各種基因功能及其同疾病的關(guān)系，也被認(rèn)為是一種具有巨大商業(yè)價值的潛在基因治療方法。

2006年47歲的安德魯·法爾克和45歲的克雷格·梅洛因發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象，獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。如今上百個RNAi藥物進(jìn)入臨床研究，RNA科學(xué)也成為現(xiàn)代生命科學(xué)最重要的研究熱點之一。

2018年8月10日是具有特別意義的一天，這一天等待了12年的首個RNAi療法藥物在美國上市了！美國Alnylam制藥和賽諾菲旗下的健贊公司（Genzyme）的RNAi新藥Onpattro（patisiran）獲得美國FDA批準(zhǔn)上市，距離2017年9月完成臨床III期試驗終點僅僅過去不到一年時間。

這款RNAi新藥用于治療遺傳性運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)介導(dǎo)(hATTR)淀粉樣病變。這種病變是一種遺傳的、由TTR基因突變引起的致命疾病。TTR蛋白主要在肝臟中產(chǎn)生，通常是維生素A的載體，TTR突變導(dǎo)致異常的淀粉樣蛋白積累，并損傷身體器官和組織，如外圍神經(jīng)和心臟，導(dǎo)致難以治療的外周感官神經(jīng)病變、自主神經(jīng)病變和心肌病。hATTR淀粉樣病缺乏有效的治療手段，死亡率很高，全球患者約5萬人，平均壽命為2.5—15年。

RNAi療法利用自身的天然基因沉默機(jī)制，降低引起TTR淀粉樣病變的TTR蛋白的水平。具體方法是將靶向TTR的小雙鏈RNA包裹在脂質(zhì)納米顆粒中，通過輸注治療方法將藥物遞送至肝臟，阻止TTR蛋白生成，減少周圍神經(jīng)中淀粉樣沉積物的積累，并恢復(fù)這些組織的功能，達(dá)到治療效果。

此前，美國FDA已授予patisiran突破性療法認(rèn)定和孤兒藥資格，允許患者在這款療法藥物正式問世前就能得到治療。RNAi療法的首個藥物上市，必將加速核酸制藥行業(yè)的發(fā)展，也是RNAi這一諾貝爾獎成果從概念走向?qū)嶋H治療用途的一個光輝里程碑。

本文作者、廣州市銳博生物科技有限公司董事長張必良（左）與2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者克雷格·梅洛

展望基因沉默技術(shù)藥物的未來

給藥難題一直制約著基因沉默技術(shù)等寡核苷酸創(chuàng)新藥物的發(fā)展，經(jīng)過近十年的技術(shù)積累，國際上以Alnylam制藥為代表的核酸藥物企業(yè)，在肝靶向核酸給藥技術(shù)方面取得了關(guān)鍵性突破。2010年Alnylam制藥發(fā)表了基于配體技術(shù)的RNAi靶向遞送的重要成果，N-乙酰半乳糖胺（GalNac）連接的siRNA核酸藥物可以有效靶向肝細(xì)胞，在內(nèi)吞作用下進(jìn)入肝臟細(xì)胞。這在核酸藥物靶向遞送上邁出關(guān)鍵一步，目前有5個GalNAc-siRNA藥物處于臨床III期研究，另有1個在新藥上市申報中。

此外，還有一些新的方法有望克服RNAi給藥在特異性和安全性方面的挑戰(zhàn)，例如，通過疏水分子修飾能提高siRNA沉默效率，利用可生物降解的離子化脂質(zhì)分子降低脂質(zhì)體納米顆粒毒性，以及利用外泌體有望進(jìn)行全身siRNA遞送；神經(jīng)細(xì)胞靶向的siRNA藥物有望給神經(jīng)性疾病的治療帶來曙光。我們相信核酸藥物及其RNAi療法的未來將具有光明的前景，期待更多創(chuàng)新核酸藥走向臨床，走向市場并惠及全球。

基因編輯技術(shù)

2012年，詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）和埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（Emanuelle Charpentier）博士在《科學(xué)》（Science）雜志上首次發(fā)表了CRISPR/Cas9的基因編輯系統(tǒng)。CRISPR基因編輯系統(tǒng)是由CRISPR RNA（crRNA）、Cas蛋白家族中的Cas9蛋白以及一段輔助用的RNA（tracrRNA），共同構(gòu)成的復(fù)合結(jié)構(gòu)。而詹妮弗·杜德納和埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶共組的團(tuán)隊，則是試圖將crRNA和tracrRNA接成一段單股RNA（sgRNA），組成了一個被廣泛應(yīng)用的CRISPR∕Cas9基因編輯系統(tǒng)。該編輯系統(tǒng)由向?qū)NA（sgRNA）和Cas9內(nèi)切酶結(jié)合組成蛋白-RNA復(fù)合體，sgRNA的5’末端的20個堿基特異性地與目標(biāo)DNA相結(jié)合，Cas9以其兩個內(nèi)切酶活性中心切斷靶標(biāo)雙鏈DNA，然后進(jìn)行DNA修補(bǔ)，達(dá)到基因編輯效果。

CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列的簡稱，Cas是CRISPR相關(guān)蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，是細(xì)菌用來識別和摧毀噬菌體和其他病原體入侵的防御體系，可以說是一種原核生物的免疫系統(tǒng)，用來抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵，同時，它為細(xì)菌提供了獲得性免疫，當(dāng)細(xì)菌遭受病毒入侵時，會產(chǎn)生相應(yīng)的“記憶”，從而可以抵抗病毒的再次入侵。在自然界中，CRISPR/Cas系統(tǒng)擁有多種類別，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)是研究最深入和應(yīng)用最成熟的一種類別。

基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)被《科學(xué)》雜志列為2013年度十大科技進(jìn)展之一。這項革命性的生物技術(shù)發(fā)明，為生物學(xué)、農(nóng)業(yè)育種和基因治療帶來強(qiáng)大的手段，極大地推動了生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用

CRISPR/Cas9是炙手可熱的基因編輯技術(shù)，由RNA引導(dǎo)靶向切割DNA，能夠方便、準(zhǔn)確、高效地對生物遺傳物質(zhì)DNA進(jìn)行修飾或編輯。由于其易操作性和高效切割效率，近幾年來成為生物學(xué)最熱門的研究領(lǐng)域之一，近年已發(fā)表了數(shù)以萬計的研究論文。

如果在基因的上下游各設(shè)計一條向?qū)NA（sgRNA1、sgRNA2），將其與Cas9蛋白一同轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，Cas9蛋白會使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。而生物體自身存在著DNA損傷修復(fù)的應(yīng)答機(jī)制，會將斷裂上下游兩端的序列連接起來，從而實現(xiàn)細(xì)胞中目標(biāo)基因的敲除。如果在此基礎(chǔ)上為細(xì)胞引入一個修復(fù)的模板質(zhì)粒（供體DNA分子），這樣細(xì)胞就會按照提供的模板在修復(fù)過程中引入片段插入或定點突變。這樣就可以實現(xiàn)基因的替換或者突變。隨著研究的深入，CRISPR/Cas技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用，除了基因敲除、基因替換等基礎(chǔ)編輯方式，它還可以被用于基因激活、疾病模型構(gòu)建和基因治療。

在動物基因編輯、疾病治療、農(nóng)業(yè)育種等領(lǐng)域，CRISPR/Cas9技術(shù)具有極為廣闊的應(yīng)用前景。目前，已有實驗室使用CRIPSR/Cas9技術(shù)治愈了小鼠的白內(nèi)障遺傳疾病，也有實驗室修復(fù)了囊性纖維癥患者的細(xì)胞缺陷疾病等。美國已批準(zhǔn)第二款CRISPR基因編輯藥物進(jìn)入臨床試驗。

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)提供了一種精準(zhǔn)而強(qiáng)力的工具，能夠逐個敲除基因組中的基因，并且觀察它給細(xì)胞帶來的影響。這對建立基因變異與疾病之間的因果關(guān)系至關(guān)重要，使用CRISPR/Cas9篩選來發(fā)現(xiàn)治療疾病的新靶點已經(jīng)取得顯著的成果。

被稱為CRISPR基因編輯領(lǐng)域“三先驅(qū)”的CRISPR Therapeutics、Editas Medicine和Intellia Therapeutic中已有兩家宣布開展CRISPR基因編輯藥物的臨床試驗。今年2月25日，總部位于瑞士楚格（Zug）的基因編輯初創(chuàng)公司CRISPR Therapeutics及其合作伙伴Vertex Pharmaceuticals Incorporated公布了CTX001臨床開發(fā)項目的最新進(jìn)展：首名患者已接受CTX001治療，這也是美國和歐盟批準(zhǔn)的首個基因編輯臨床試驗。

隨著基因沉默（RNAi）、基因編輯（CRISP/Cas）以及mRNA治療等重大生物新技術(shù)的不斷出現(xiàn)，“核酸”生命科學(xué)領(lǐng)域一次又一次成為科學(xué)界和工業(yè)界關(guān)注的焦點。核酸技術(shù)在人類與疾病的抗?fàn)幹袑l(fā)揮重要作用，為疾病的治療提供了新型的療法，繼抗體藥物之后新一代核酸醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)有望迎來輝煌發(fā)展。

廣州市銳博生物科技有限公司主要開展RNA檢測與功能研究、開發(fā)核酸藥物、基因檢測儀器與試劑的研發(fā)等，圖為公司GMP核酸藥物生產(chǎn)車間