高 媛,馮曉元,姜 楠,王 蒙,平 華,左驥民,馬智宏,*

(1.北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京),北京 100097;2.北京市大興區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站,北京 102607)

櫻桃營(yíng)養(yǎng)豐富,因富含多種有效成分而具有一定的保健價(jià)值,其中尤以酚類(lèi)物質(zhì)最為突出[1]。酚類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抑菌等生物活性。酚酸是酚類(lèi)物質(zhì)中的一類(lèi),約占植物源食品中酚類(lèi)化合物的三分之一,多為苯甲酸和肉桂酸的羥化衍生物。研究表明,酚酸還與果蔬采后運(yùn)輸、果實(shí)色澤、風(fēng)味等密切相關(guān)[2-3]。酚酸類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)和含量因品種、產(chǎn)地、發(fā)育階段、提取方式等不同而有所差異[4-5]。

果蔬中的酚酸類(lèi)物質(zhì)根據(jù)存在形式可以分為游離型、游離酯型和結(jié)合型。游離酯型和結(jié)合型酚酸可在酸、堿或酶的作用下水解釋放出來(lái),從而被檢測(cè)到。且有研究表明,對(duì)于植物中存在的絕大多數(shù)游離酯型,在堿性條件下更容易水解,酸性條件則不利于酚酸的釋放[6]。不同形態(tài)的酚酸已在多種水果中得到分離和鑒定[7-8]。盡管關(guān)于櫻桃中酚酸的組成和含量已有很多報(bào)道,但大多數(shù)研究?jī)H關(guān)注了可溶性的游離型酚酸,而對(duì)游離酯型和結(jié)合型關(guān)注較少。研究表明,游離酯型酚酸在體內(nèi)外試驗(yàn)中均具有較強(qiáng)的抗氧化活性[5,9]。因此,全面分析櫻桃中酚酸類(lèi)物質(zhì)的含量和組成能更好的分析其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對(duì)5個(gè)櫻桃品種,包括彩虹、艷陽(yáng)、薩米脫、23-51和瓦列里中的游離型、游離酯型和結(jié)合型酚酸含量進(jìn)行測(cè)定和差異性評(píng)估,并對(duì)其抗氧化特性進(jìn)行了分析,以期為櫻桃中功能成分開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5個(gè)甜櫻桃品種彩虹、艷陽(yáng)、薩米脫、23-51和瓦列里 均采自北京市林業(yè)果樹(shù)科學(xué)研究院試驗(yàn)園(北京通州,39°41′N(xiāo),116°41′E)。采樣時(shí),挑選大小一致,無(wú)損傷,無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí),用保溫袋包裹,放進(jìn)泡沫保溫箱中,在2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。每個(gè)品種采集三個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)約2 kg。

Acquity TM超高效液相色譜儀-TQS串聯(lián)質(zhì)譜儀、電噴霧電離(electron spray ionization,ESI)接口 美國(guó)Waters公司;IKA A11分析研磨機(jī)、KS260搖床 德國(guó)IKA公司;BUCHI-R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI;Milli-Q超純水機(jī) 美國(guó)Mimpore公司;3-30k臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;PAL-2手持糖度計(jì) 日本ATAGO;pHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 采集的櫻桃樣品中部分用來(lái)測(cè)定單果重、可溶性固形物含量(Brix)、pH和可滴定酸;剩余樣品用于酚酸類(lèi)物質(zhì)的提取和測(cè)定,在液氮保護(hù)下研磨成粉末,于-80 ℃保存待用。

1.2.2 不同品種櫻桃理化指標(biāo)的測(cè)定 取櫻桃果實(shí)30顆稱重,計(jì)算單果重。30顆果實(shí)擠壓取上清獲得櫻桃汁,可溶性固形物含量(SSC)使用手持糖度計(jì)測(cè)量。pH采用電子pH計(jì)測(cè)定?？傻味ㄋ?TA)使用酸堿滴定法測(cè)定,吸取2 mL上清液,加蒸餾水50 mL,并滴加酚酞指示劑2滴,用0.1 mol/L NaOH滴定至微紅色，且30 s不褪色,測(cè)定結(jié)果以乳酸計(jì)。

1.2.3 酚酸類(lèi)物質(zhì)的提取

1.2.3.1 游離型酚酸 酚酸提取參照本實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化的方法做了適當(dāng)改動(dòng)[10]。取10 g樣品于50 mL離心管中,加入20 mL 80%甲醇水提取液(v/v,含0.1%鹽酸),渦旋振蕩10 s,室溫下超聲提取20 min,超聲功率700 W,于4 ℃ 10000 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶。重復(fù)上述步驟一次,合并上清液,定容至50 mL?；靹蚝筮^(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜,待測(cè)。

1.2.3.2 游離酯型酚酸 游離酯型酚酸提取方法參考Li等[11]的方法并做了適當(dāng)修改。取10 g樣品于50 mL離心管中,加入20 mL 80%甲醇水提取液(v/v,含0.1%鹽酸),渦旋混勻,室溫下超聲提取20 min,超聲功率700 W,于4 ℃ 10000 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL雞心瓶。重復(fù)上述步驟一次,合并上清液,剩余殘?jiān)捎糜诮Y(jié)合型酚酸的測(cè)定,上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上在40 ℃下減壓蒸發(fā)至15 mL以內(nèi)。轉(zhuǎn)移至100 mL離心管中,加入20 mL 4 mol/L NaOH,充入N2,40 ℃氣浴振蕩避光水解2 h。之后用濃HCl調(diào)節(jié)pH至2。20 mL乙酸乙酯萃取兩次,合并萃取液,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40 ℃下減壓蒸發(fā)至近干,用10 mL 50%甲醇水(v/v)溶解,混勻過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜,備用。該提取方法中,游離型和游離酯型酚酸均被乙酸乙酯萃取,因此最終游離酯型酚酸含量為該部分得到的酚酸含量減去上一節(jié)(1.2.3.1)中對(duì)應(yīng)游離型酚酸的數(shù)據(jù)。

1.2.3.3 結(jié)合型酚酸 取上一步離心后剩余的殘?jiān)?加入20 mL 4 mol/L NaOH,充入N2,40 ℃氣浴振蕩,避光水解2 h,濃HCl調(diào)節(jié)pH至2。用20 mL乙酸乙酯萃取兩次,合并萃取液,40 ℃下減壓蒸發(fā)至近干,用10 mL 50%甲醇水(v/v)溶解,混勻過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜,備用。

1.2.4 分離和檢測(cè) 色譜條件:色譜柱為Acquity HSS C18 column(2.1×150 mm;1.8 μm);柱溫45 ℃;樣品室溫度10 ℃,進(jìn)樣體積5 μL;流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液;流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈;梯度洗脫條件:初始流動(dòng)相A為95%,保持0.5 min,4.5 min 內(nèi)降至70%,隨后在4.5 min內(nèi)降至10%,保持0.5 min后在0.5 min內(nèi)升至95%,保持2.5 min;流速0.3 mL/min;總運(yùn)行時(shí)間為13 min。

質(zhì)譜條件:離子源模式采用正負(fù)離子模式(ESI+和ESI-);毛細(xì)管電壓2.5 kV(ESI+)/-1.5 kV(ESI-);離子源溫度為150 ℃,脫溶劑氣溫度為500 ℃,去溶劑氣流量為1000 L/h,錐孔氣流速為150 L/h。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple Reaction Monitoring,MRM)模式。

1.2.5 酚類(lèi)物質(zhì)的定量分析 分別稱取各酚酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,配制成1 mg/mL的酚酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃保存。酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液采用梯度稀釋法現(xiàn)用現(xiàn)配。將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,依次逐級(jí)稀釋,配制成一系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。以峰面積與相應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸,得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。樣品分析采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。

1.2.6 抗氧化性測(cè)定 DPPH自由基清除能力的測(cè)定:取0.2 mL上清液,加入0.3 mL的乙醇,再加入2.5 mL的100 μmol/L DPPH充分混合,室溫避光放置30 min后,測(cè)定517 nm下的吸光度值A(chǔ)1。對(duì)照采用無(wú)水乙醇溶液代替樣品加入2.5 mL的100 μmol/L DPPH溶液中,其余操作同上,517 nm下得到的吸光度值為A0。重復(fù)3次。根據(jù)以下公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH的抑制率:

DPPH清除能力(%)=(1-A1/A0)×100

式中:A0:未加樣品液時(shí)DPPH溶液的吸光度值;A1:加樣品液時(shí)DPPH溶液的吸光度值。

鐵還原能力的測(cè)定(FRAP):取2.5 mL用40 mmol/L HCl溶解的10 mmol/L TPTZ(Sigma Chemical Co.,St. Louis,MO),2.5 mL的20 mmol/L的FeCl3·6H2O和25 mL 0.3 mol/L醋酸緩沖液(pH3.6)混合得到FRAP溶液。將新鮮配制的FRAP溶液放置于37 ℃水浴中保溫。取120 μL待測(cè)溶液,與3.6 mL水浴的FRAP溶液和360 μL去離子水充分混合,在37 ℃水浴中保溫10 min。于593 nm測(cè)定反應(yīng)液的吸光值。空白采用120 μL去離子水代替樣品。樣品反應(yīng)液的吸光值應(yīng)在以FeSO4·7H2O為標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)。樣品鐵還原能力與1 mmol/L FeSO4·7H2O有相同抗氧化能力的量相比較,用μmol Fe2+·g-1·FW表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù),數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。單因素方差分析(ANOVA)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0完成,采用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性方差分析,顯著性水平p<0.05。不同品種櫻桃酚類(lèi)物質(zhì)偏最小二乘判別分析利用數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站http://www.metaboanalyst.ca/完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種櫻桃果實(shí)理化指標(biāo)分析

5個(gè)品種櫻桃果實(shí)的單果重、可溶性固形物含量、pH和可滴定酸含量見(jiàn)表1。從表中可以看出,艷陽(yáng)單果重最大,而23-51最小。艷陽(yáng)單果重略微小于Ballistreri等的報(bào)道[12],研究表明,果實(shí)重量除與品種有關(guān)外,還與負(fù)載量、果實(shí)成熟階段等有關(guān)[13-14]?？扇苄怨绦挝锖亢涂傻味ㄋ嵩诓煌贩N間有所差異。其中,薩米脫的可溶性固形物含量最高(18.39 °Brix);可滴定酸變化范圍從0.85%(23-51)～1.15%(瓦列里);而pH變化從3.76～4.01。可滴定酸和pH與文獻(xiàn)報(bào)道范圍一致[12,15]。

表1 不同品種櫻桃理化指標(biāo)(n=3)

2.2 不同品種櫻桃中的酚酸類(lèi)物質(zhì)

櫻桃中的酚酸主要以三種形態(tài)存在,游離型、游離酯型和結(jié)合型。游離型酚酸通過(guò)提取可以直接被檢測(cè)到,游離酯型和結(jié)合型酚酸通常以酯鍵、醚鍵等與許多化合物連接在一起,需要經(jīng)過(guò)水解釋放出來(lái)才能被檢測(cè)到。酚酸類(lèi)物質(zhì)根據(jù)結(jié)構(gòu)不同,可以分為羥基苯甲酸類(lèi)和羥基肉桂酸類(lèi)。不同品種櫻桃中的酚酸含量見(jiàn)表2。

表2 不同品種櫻桃中的游離型、游離酯型和結(jié)合型酚酸含量(mg/kg FW)

游離型酚酸:不同櫻桃品種中共檢出4種游離型酚酸,包括新綠原酸、綠原酸、香草酸和對(duì)羥基苯甲酸。櫻桃中的游離型酚酸以新綠原酸含量最高,其次是綠原酸,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5,16-17]。不同品種間酚酸含量差異較大。其中,瓦列里櫻桃中的新綠原酸含量最高(413.81 mg/kg FW),其次為薩米脫,艷陽(yáng)中含量最低。酚酸含量因品種、栽培模式、果實(shí)成熟階段、儲(chǔ)藏條件等不同而有所差異[4,14-15]。此外,櫻桃中還含有較低含量的香草酸和對(duì)羥基苯甲酸,這兩種酚酸在23-51中含量最高。

游離酯型酚酸是一種可通過(guò)甲醇水溶液直接提取的可溶性成分,但與可溶性糖、多肽等通過(guò)酯鍵或醚鍵相連,需要通過(guò)水解才能釋放出來(lái)[18-19]。游離酯型酚酸總量在瓦列里中含量最高,其次是23-51和薩米脫,彩虹中含量最低。櫻桃中的游離酯型酚酸以咖啡酸為主,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5];5個(gè)品種中瓦列里中的咖啡酸含量最高,彩虹中含量最低。除咖啡酸外,彩虹、艷陽(yáng)和薩米脫中對(duì)香豆酸具有較高的含量,而對(duì)于23-51和瓦列里,則是原兒茶酸高于其他種類(lèi)酚酸。研究表明,咖啡酸和對(duì)香豆酸均具有較強(qiáng)的抗氧化活性和自由基清除能力[20]。此外,23-51中還含有相對(duì)較高含量的香草酸。

結(jié)合型酚酸是不可溶性酚酸,不能直接被甲醇溶液提取,多與細(xì)胞壁多糖、木質(zhì)素等通過(guò)酯鍵或醚鍵相連,需經(jīng)水解才能釋放出來(lái)[18,21]。櫻桃中共檢測(cè)到4種結(jié)合型酚酸,包括2種羥基苯甲酸類(lèi)(香草酸和原兒茶酸)和2種羥基肉桂酸類(lèi)(咖啡酸和對(duì)香豆酸)。23-51中的結(jié)合型酚酸總量最高,彩虹中含量最低。與游離酯型酚酸類(lèi)似,櫻桃中的結(jié)合型酚酸同樣以咖啡酸含量最高。結(jié)合型的咖啡酸和對(duì)香豆酸在文獻(xiàn)中被報(bào)道過(guò)[5],而原兒茶酸和香草酸是第一次被檢出。

不同形態(tài)酚酸在多種水果、谷物麩皮中得到分析[7,22],但關(guān)于櫻桃中不同形態(tài)酚酸的測(cè)定報(bào)道較少,目前僅在一篇文獻(xiàn)中被報(bào)道過(guò)[5],大部分都僅關(guān)注了游離型酚酸。從分析結(jié)果來(lái)看,櫻桃中的游離酯型酚酸可占酚酸總量的38%～51%。游離酯型酚酸在植物抗氧化作用中也發(fā)揮著重要作用[18,23]。因此,全面分析酚酸的含量及存在形式,能更好的解釋其生物活性及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.3 抗氧化性分析

不同形態(tài)酚酸提取液DPPH自由基清除能力和鐵還原能力(FRAP)的測(cè)定結(jié)果如圖1所示(由于結(jié)合型酚酸類(lèi)物質(zhì)提取液抗氧化特性很低,未在圖中展示)。從圖中可以看出,DPPH自由基清除能力和鐵還原能力測(cè)定的抗氧化性結(jié)果趨勢(shì)一致。結(jié)果表明,瓦列里酚酸類(lèi)物質(zhì)提取液的DPPH自由基清除能力和FRAP均最高。另外,五個(gè)櫻桃品種中,游離型酚類(lèi)物質(zhì)提取液的抗氧化性要高于游離酯型的。且抗氧化性指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果與酚酸類(lèi)物質(zhì)含量呈現(xiàn)較高的一致性。

圖1 不同品種甜櫻桃提取液抗氧化性分析

2.4 偏最小二乘判別分析

為了更好的比較不同櫻桃品種間酚酸類(lèi)物質(zhì)的差異,以5個(gè)櫻桃品種中檢測(cè)到的各酚酸物質(zhì)總量(包括游離型、游離酯型和結(jié)合型)為變量進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA),結(jié)果如圖2所示。得分散點(diǎn)圖(圖2a)和VIP得分圖(圖2b)共同反應(yīng)了不同品種櫻桃與酚酸類(lèi)物質(zhì)之間的關(guān)系。前兩個(gè)主成分解釋了總方差的99.0%,其中主成分1占總方差的97.4%。從散點(diǎn)圖可以看出,五個(gè)不同櫻桃品種能夠較好的區(qū)分開(kāi)。VIP得分一般用來(lái)評(píng)價(jià)各代謝組分對(duì)區(qū)分各個(gè)品種/處理的貢獻(xiàn)值,從VIP得分圖可以看出,新綠原酸和咖啡酸是區(qū)分五個(gè)櫻桃品種貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)(一般認(rèn)為VIP>1的組分對(duì)區(qū)分組間差異有貢獻(xiàn)),也是造成品種間差異的主要化合物;在五個(gè)櫻桃品種中,差異最大的兩個(gè)物質(zhì)新綠原酸和咖啡酸均在瓦列里中含量最高。

圖2 不同品種甜櫻桃中酚酸類(lèi)物質(zhì)偏最小二乘判別分析

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS對(duì)五個(gè)不同品種甜櫻桃中的不同形態(tài)酚酸(包括游離型、游離酯型和結(jié)合型)進(jìn)行了測(cè)定和分析。結(jié)果表明,不同品種間酚酸總量差異較大。三種形態(tài)酚酸中,游離型和游離酯型酚酸占酚酸總量的94%以上,結(jié)合型酚酸含量較低。不同櫻桃品種中,游離型酚酸均以新綠原酸為主,游離酯型和結(jié)合型酚酸以咖啡酸含量最高。游離型和游離酯型酚酸總量在瓦列里中含量最高(分別為435.69和261.93 mg/kg FW);而對(duì)于結(jié)合型酚酸,則是在23-51中含量最高(16.92 mg/kg FW)。不同形態(tài)酚酸DPPH自由基清除能力和鐵還原能力測(cè)定結(jié)果與酚酸含量具有一致性。PLS-DA結(jié)果顯示新綠原酸和咖啡酸是區(qū)分不同甜櫻桃品種貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)。研究結(jié)果將為果蔬中不同形態(tài)酚酸鑒定及功能性產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供一定的參考價(jià)值。