舒蕊 劉健 章玉萍 張麗麗 陳明 代君君 范濤

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，合肥 230031）

蜜蜂是昆蟲膜翅目家族中的重要成員，不僅是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是科學(xué)研究中的模式生物。我國飼養(yǎng)的西方蜜蜂品種中，黃色蜂種占有較大比重，特別是以意大利蜜蜂為主的黃色蜂種。意蜂群中的個(gè)體表現(xiàn)出不同程度黃體色：雄蜂為黃色到暗棕色，絨毛淡黃色尤為明顯；工蜂的腹部具兩個(gè)黃色環(huán)帶的個(gè)體居多，絨毛淡黃色；蜂王的腹部多為黃色到暗棕色，尾部黑色，只有少數(shù)蜂王通體都是黃色。黃色蜂種及其雜交種遍布全國各地，在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用[1]。然而，意蜂黃體色的形成機(jī)制一直未解。眾所周知，昆蟲黃色色素的形成源自蝶呤類色素，四氫生物蝶呤（BH4）合成途徑與蝶呤類色素的合成與代謝息息相關(guān)。BH4是芳香族氨基酸羥化酶的必需輔酶，也是一氧化氮合酶（NOS）的重要輔助因子，還能作為NOS的調(diào)控因子或直接作為自由基清除劑參與氧化應(yīng)激作用[2,3]。BH4的合成不足會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)的缺乏以及細(xì)胞內(nèi)皮功能障礙，引發(fā)多種神經(jīng)性生理代謝疾病，臨床醫(yī)學(xué)上把口服BH4作為治療其中某些疾病的有效方法[4-6]?，F(xiàn)階段，BH4合成代謝網(wǎng)絡(luò)在雙翅目模式生物黑腹果蠅和鱗翅目模式生物家蠶中都有較多的研究，但是在以蜜蜂為代表的膜翅目昆蟲中幾乎沒有研究報(bào)道。研究蜜蜂體內(nèi)BH4合成途徑對(duì)于意蜂乃至膜翅目的色素合成與代謝至關(guān)重要。

6-丙酮酰四氫蝶呤合酶（6-pyruvoyl tetrahydrobiopterin synthase，PTS）是BH4合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶。PTS催化BH4從頭合成途徑中的第二步反應(yīng)，即催化二氫新蝶呤三磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-丙酮酰四氫蝶呤（PTP），該反應(yīng)依賴于Mg2+和Zn2+[7-9]。人類和哺乳動(dòng)物的PTS基因結(jié)構(gòu)是高度保守的，它們的基因組序列有6～7kbp，包含6個(gè)外顯子。研究表明，PTS酶的功能異常導(dǎo)致BH4合成受阻，從而引起人類罹患BH4缺乏癥。此類患者體內(nèi)分離發(fā)現(xiàn)了大量的PTS基因突變的位點(diǎn)，其中44個(gè)突變位點(diǎn)分布在PTS基因所有的6個(gè)外顯子和前面3個(gè)內(nèi)含子的區(qū)域內(nèi)。除了大量的突變位點(diǎn)，不同物種的PTS基因表達(dá)與調(diào)控方式也有不同。比如，果蠅的PTS基因轉(zhuǎn)錄了兩種類型的PTS mRNA：一類是受近端啟動(dòng)子作用的，只在頭部特異出現(xiàn)，具有3個(gè)外顯子的序列；另一類是受遠(yuǎn)端啟動(dòng)子作用的，在5’端非翻譯區(qū)多了一段新的內(nèi)含子序列。但是這兩類mRNA在果蠅體內(nèi)表達(dá)的ORF序列是一樣的[10]。

生物信息學(xué)方法在功能基因的測序、識(shí)別、功能預(yù)測、結(jié)構(gòu)分析等方面都發(fā)揮著重要作用。自意蜂基因組全序列測序完成后，越來越多的生物信息學(xué)方法應(yīng)用到意蜂各類基因的研究工作中。生物信息學(xué)分析將促進(jìn)人們對(duì)于意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶的了解和認(rèn)識(shí)。

本文選擇意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶，采用生物信息學(xué)方法，對(duì)其相應(yīng)氨基酸序列的理化性質(zhì)、疏水性、跨膜區(qū)、結(jié)構(gòu)功能域以及空間二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行分析和預(yù)測，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，旨在為日后深入研究意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶家族的結(jié)構(gòu)和功能解析及應(yīng)用等方面提供有力幫助和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列來源

來自NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的意大利蜜蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶（序列號(hào)XM-623992）。

1.2 方法

使用ProtScale分析蛋白質(zhì)疏水性，使用ORFFinder和ProtParam對(duì)編碼意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶的氨基酸組分和理化性質(zhì)進(jìn)行分析，使用網(wǎng)站TMHMM預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)，結(jié)構(gòu)功能域分析使用SMART服務(wù)器，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測使用PORTER完成，蛋白質(zhì)三級(jí)建模使用SWISS-MODEL完成，使用軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)分析

使用ORF Finder和ProtParam分析意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶的蛋白組分和理化性質(zhì)(表1)。意蜂PTS基因全長829bp，含有一個(gè)429bp的開放閱讀框，編碼142個(gè)氨基酸，氨基酸組成中，不含Pyl和Sec，Lys含量最高，達(dá)到11.3%。含有20個(gè)酸性氨基酸（Asp+Glu），20個(gè)堿性氨基酸（Arg+Lys），氨基酸序列的不穩(wěn)定系數(shù)為33.06，說明此蛋白是穩(wěn)定的。預(yù)測蛋白分子量為16.66027kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為6.96，原子組成為C745H1179N195O219S9，脂肪族氨基酸指數(shù)為89.08，親水性指數(shù)為-0.499，表明其為親水性蛋白。

2.2 疏水性分析

圖1 意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶氨基酸序列的疏水性分析

ExPASy的ProtScale是常用的預(yù)測蛋白質(zhì)疏水性的分析方法。使用ProtScale工具在線分析意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶的疏水性（圖1），其計(jì)算方法是基于K-D法的蛋白質(zhì)疏水性。6-丙酮酰四氫蝶呤合酶氨基酸序列中負(fù)值的親水性氨基酸的比例高于正值的疏水性氨基酸，因而判斷其為親水性蛋白，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。

表1 意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶基因蛋白組分和理化性質(zhì)

2.3 跨膜區(qū)分析

使用TMHMM工具對(duì)意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶進(jìn)行跨膜區(qū)分析（圖2）?；赥MHMM計(jì)算的后驗(yàn)概率，6-丙酮酰四氫蝶呤合酶的142個(gè)氨基酸都在膜外，該酶是一個(gè)典型的膜外蛋白，不是跨膜蛋白質(zhì)。

圖2 意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶氨基酸序列的跨膜區(qū)分析

2.4 結(jié)構(gòu)功能域分析

分析結(jié)構(gòu)功能域?qū)τ诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)的分類和預(yù)測非常重要，使用SMART服務(wù)器進(jìn)行意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶的結(jié)構(gòu)功能域分析（圖3）。意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶在序列的7～140位點(diǎn)含有一個(gè)6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶結(jié)構(gòu)域。

圖3 意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶結(jié)構(gòu)功能域分析

2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測既是聯(lián)系一級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的紐帶，也為后續(xù)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測提供信息。使用PORTER服務(wù)器預(yù)測意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4）。意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶主要由4種二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，預(yù)測結(jié)果顯示58個(gè)氨基酸為α-螺旋，占比40.85%，其次是無規(guī)卷曲共41個(gè)氨基酸，占比28.87%，35個(gè)氨基酸是β-折疊，共占24.65%，β-轉(zhuǎn)角有8個(gè)氨基酸，占5.63%。

圖4 意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.6 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬

蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能在很大程度上是由其空間結(jié)構(gòu)決定的，將蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)分析清楚是理解其功能的關(guān)鍵。通過SWISS-MODEL同源建模意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，一般相似性超過50%即可獲得較精確的結(jié)構(gòu)模型（ID：3i2b.1.A，序列一致性56.52%），同源建模如圖5。

2.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)育分析是生物信息學(xué)中的重要研究領(lǐng)域，通過它的計(jì)算分析可以判斷物種之間的親緣關(guān)系。本研究先在NCBI網(wǎng)站中搜索PTS序列信息，然后分別選擇膜翅目、雙翅目、鱗翅目、鞘翅目共15種昆蟲的PTS蛋白序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）。分析結(jié)果表明，意大利蜜蜂與小蜜蜂、大蜜蜂以及中華蜜蜂的進(jìn)化關(guān)系最密切。該結(jié)果為后續(xù)開展意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶家族功能基因的實(shí)驗(yàn)研究提供了參考信息。

圖6 15種昆蟲6-丙酮酰四氫蝶呤合酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

蜜蜂在生物學(xué)上是全變態(tài)昆蟲，在農(nóng)業(yè)上是重要的授粉昆蟲，在科研中亦是重要的模式生物。目前對(duì)昆蟲6-丙酮酰四氫蝶呤合酶基因的研究多集中在果蠅和家蠶等其他種類的昆蟲上，而膜翅目意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶基因的研究卻鮮有報(bào)道。意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶基因在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能方面相對(duì)于其他昆蟲是否有特別之處，需要科學(xué)工作者們做更多的研究與探索。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)意大利蜜蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶基因進(jìn)行了系統(tǒng)分析，結(jié)果表明，意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶基因全長829bp，含有一個(gè)429bp的開放閱讀框，編碼142個(gè)氨基酸，屬于親水性蛋白；預(yù)測蛋白分子量為16.66027kD，理論等電點(diǎn)（pI）為6.96，原子組成為C745H1179N195O219S9；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成；在序列的7～140位點(diǎn)含有一個(gè)6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶結(jié)構(gòu)域，含有相應(yīng)的催化結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合域；蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成，其次是無規(guī)卷曲和β-折疊，同源建模了蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；使用15種6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析結(jié)果與傳統(tǒng)的生物學(xué)分類結(jié)果一致。

本文的研究結(jié)果為深入開展意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶的科學(xué)研究提供參考信息，為意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶基因家族的分離、純化及克隆分析提供參考，也為進(jìn)一步研究其高級(jí)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供理論依據(jù)。本文是基于生物信息學(xué)工具對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行的系統(tǒng)研究，關(guān)于意蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶的具體生物學(xué)功能和表達(dá)機(jī)制等還需進(jìn)一步研究。