干酪乳桿菌LC01對(duì)小鼠腸道菌群和腸道轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)作用的劑量效應(yīng)

陸文偉，胡文兵，曹文金，楊震南，丁歷偉，楊京梅，陳 衛(wèi),*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.杭州味全食品有限公司，浙江 杭州 310018）

人體腸道是一個(gè)極其復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)[1]。在這個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)之中，腸道菌群、營(yíng)養(yǎng)素以及宿主細(xì)胞有著緊密的聯(lián)系[2-4]。腸道菌群中本身就含有條件致病菌，一旦腸道菌群失調(diào)可能會(huì)誘發(fā)這類細(xì)菌產(chǎn)生毒素或者侵染腸道黏膜，造成系統(tǒng)性的感染[5-6]。另外，腸道菌群的失調(diào)也會(huì)引起人體對(duì)相關(guān)營(yíng)養(yǎng)素的代謝失衡。因此，腸道菌群的失調(diào)會(huì)給人體健康帶來(lái)較大的負(fù)面影響[7]。越來(lái)越多的研究表明，腸道菌群的失調(diào)會(huì)引起肥胖、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和腸易激綜合征等疾病[8-10]。

世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織定義益生菌是一類活的微生物，攝入足量益生菌會(huì)對(duì)宿主健康有益[11]。益生菌具有拮抗腸道致病菌，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，重建失調(diào)的腸道菌群以及調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)等功效[12-15]。最常用于食品的益生菌主要是乳酸桿菌和雙歧桿菌，且主要來(lái)源于發(fā)酵制品。酸奶不僅是一類風(fēng)味良好、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的發(fā)酵制品，更是益生菌重要的食物載體。因此，從酸奶中篩選具有優(yōu)良益生特性的益生菌菌株不僅安全，而且簡(jiǎn)單易行，具有十分重要的意義。

益生菌Lactobacillus caseiLC01具有良好的耐酸、耐膽鹽特性，目前已被廣泛用于乳品工業(yè)[16]。本研究以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)灌胃LC01菌株，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)分析正常小鼠以及青霉素干預(yù)小鼠的腸道菌群差異，評(píng)價(jià)LC01菌株對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，并探討其對(duì)小鼠腸道轉(zhuǎn)運(yùn)率的影響，為開(kāi)發(fā)LC01菌株作為有益人體健康的益生菌提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

清潔級(jí)BALB/c雄性小鼠130 只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：311620400001877，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0006。

Lactobacillus caseiLC01菌株（300億組活菌數(shù)為1.25×108CFU/mL；600億組活菌數(shù)為2.5×108CFU/mL）購(gòu)自丹麥科漢森公司。

鹽酸洛哌丁胺膠囊（2 mg/粒，6 粒/盒，批號(hào)：161028325） 西安楊森制藥有限公司；注射用青霉素鈉（0.48 g，8×105U/g，批號(hào)：20160303） 哈藥集團(tuán)有限公司獸藥廠；MRS培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；土壤基因組提取試劑盒 美國(guó)MP Biomedicals公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GRP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RC BIOS 10型冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；FE-20型pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

采用MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)LC01菌，生長(zhǎng)至穩(wěn)定前期時(shí)，室溫條件下5 000 r/min離心5 min收集菌體，菌體沉淀用pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后，加入脫脂乳后凍干成菌粉。菌粉再經(jīng)蒸餾水復(fù)溶后制成5×108CFU/mL菌懸液。

1.3.2 動(dòng)物分組及處理?xiàng)l件

動(dòng)物于屏障環(huán)境（使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2016-0011）下飼養(yǎng)，室內(nèi)環(huán)境溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%。室內(nèi)環(huán)境保持清潔、安靜，12 h/12 h白天-黑夜循環(huán)光照。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，小鼠隨機(jī)分為3 個(gè)大組（模型1、模型2和模型3），分別用于評(píng)價(jià)LC01菌對(duì)正常小鼠菌群、青霉素處理后小鼠菌群以及便秘模型小鼠腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。具體分組和處理?xiàng)l件如表1所示，其中300億組、600億組服用LC01的劑量根據(jù)人與小鼠的等效劑量系數(shù)之算法換算得到，稀釋1.3.1節(jié)制備的菌懸液灌胃小鼠。

表1 小鼠分組及處理情況Table 1 Grouping and treatment of mice

1.3.3 小鼠糞便宏基因組的提取

收集模型1和模型2小鼠停止灌胃一周后的小鼠糞便，使用土壤基因組提取試劑盒提取小鼠糞便的宏基因組。具體方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4 16S rRNA擴(kuò)增分析

通過(guò)N a n o D r o p 2 0 0 0和瓊脂糖凝膠電泳來(lái)評(píng)價(jià)提取效果，總體顯示提取的基因組D N A濃度和純度都符合進(jìn)一步建庫(kù)要求。使用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'）和907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'），擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)，分析小鼠腸道菌群多樣性。純化后的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物等量混合構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，使用Illumina的MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控過(guò)濾得到有效序列用于分析小鼠腸道菌群在分別服用300億活菌和600億活菌的多樣性變化。

1.3.5 小腸推進(jìn)率的測(cè)定

末次給藥0.5 h后，各組小鼠均用墨汁灌胃。0.5 h后立即脫頸處死小鼠，打開(kāi)腹腔，剪取上端自幽門，下端至回盲腸結(jié)點(diǎn)的腸管，置于托盤(pán)上，輕拉小腸至直線，測(cè)量腸管長(zhǎng)度為小腸總長(zhǎng)度，幽門至墨汁前沿為墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度，按照以下公式計(jì)算小腸推進(jìn)率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析判斷，P＜0.05視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC01菌株對(duì)正常小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

2.1.1 LC01菌株對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響

圖1 不同LC01菌株劑量對(duì)正常小鼠腸道菌群豐度及多樣性的影響Fig. 1 Effect of different doses of LC01 on relative abundance and diversity of intestinal microbiota in normal mice

如圖1所示，正常小鼠灌胃2 周LC01菌株（300億、600億）后，小鼠腸道優(yōu)勢(shì)菌屬（相對(duì)豐度大于1%）的結(jié)構(gòu)組成并未發(fā)生顯著變化，擬桿菌屬（Bacteroides）、梭菌屬（Clostridium）、毛螺菌（Lachnospira）、乳桿菌屬（Lactobacillus）依舊為優(yōu)勢(shì)菌群，說(shuō)明正常小鼠腸道優(yōu)勢(shì)菌屬的組成相對(duì)穩(wěn)定。進(jìn)一步分析不同組別小鼠腸道菌群的β多樣性來(lái)說(shuō)明LC01菌株對(duì)小鼠腸道菌群的影響。

圖2 不同LC01菌株劑量對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)β多樣性的影響Fig. 2 Effect of different doses of LC01 on β diversity of intestinal microbiota in mice

如圖2所示，相對(duì)于空白組，300億組和600億組小鼠腸道微生物菌群的β多樣性具有顯著差異。PCA分析發(fā)現(xiàn)，空白組、300億組和600億組小鼠腸道內(nèi)菌群多樣性均有明顯的聚類現(xiàn)象，說(shuō)明LC01菌株的灌胃劑量對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響顯著。

2.1.2 LC01菌株對(duì)小鼠腸道菌群不同菌屬相對(duì)豐度的影響

圖3 LC01菌株對(duì)小鼠腸道菌群不同菌屬相對(duì)豐度的影響Fig. 3 Effect of LC01 on relative abundance of intestinal microbiota at the genus level

在菌群分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較各個(gè)處理組小鼠腸道菌群中不同菌屬相對(duì)豐度的變化。結(jié)果如圖3所示，相對(duì)于空白組的（2.90±1.34）%，300億和600億組中的Lactobacillus屬相對(duì)豐度均有顯著增加，分別提高至（14.22±13.24）%（P＜0.05）和（22.85±9.34）%（P＜0.001），說(shuō)明LC01菌株可以顯著增加小鼠腸道內(nèi)乳桿菌的相對(duì)豐度。乳桿菌屬不同菌種具有顯著的益生效果，包括抑制致病菌，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，改善血脂，減輕乳糖消化不良癥狀，抗氧化等功效[17-20]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，活菌組的Bacteroides和Bacteroides S24-7屬豐度顯著增加（P＜0.05），而同為擬桿菌門的Odoribacter屬豐度則極顯著降低（P＜0.01)。相對(duì)于空白組，活菌組的毛螺菌科未定菌屬豐度顯著降低（P＜0.05），而梭菌目未定菌屬和Rikenellaceae未定菌屬則均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異（P＞0.05）。此外，600億組Prevotella屬相對(duì)豐度顯著降低，由空白組的（3.97±1.37）%降低至（0.99±0.78）%（P＜0.001），提示LC01菌株的細(xì)胞組份可以顯著地抑制小鼠腸道內(nèi)Prevotella屬的增殖，并且菌量越高，其抑制效果越明顯。研究發(fā)現(xiàn)Prevotella屬是臨床上較常見(jiàn)的一種條件致病菌，在促炎環(huán)境中很旺盛，并在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中扮演著關(guān)鍵的角色[21-22]。LC01株的細(xì)胞組分可以顯著降低小鼠腸道中Prevotella屬的相對(duì)豐度，具有潛在緩解風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用?；罹MHelicobacter屬的相對(duì)豐度顯著降低，由空白組的（3.00±1.89）%降低至300億組的（1.12±1.01）%（P＜0.01）和600億組的（0.82±0.42）%（P＜0.001），表明LC01菌株可以顯著降低小鼠腸道中Helicobacter屬的相對(duì)豐度。Helicobacter屬是人體條件致病菌，可引起慢性腸炎和胃癌等疾病，提示LC01菌株可能具有預(yù)防慢性腸炎和胃癌的功效。

2.2 LC01菌株對(duì)青霉素導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)的影響

2.2.1 LC01菌株顯著改善青霉素導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)

腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致眾多疾病，包括慢性代謝疾病、肝臟疾病和腸道疾病等[23]。因此，改善腸道菌群失調(diào)可營(yíng)造良好的腸道環(huán)境，有利于維護(hù)人體健康。本研究利用青霉素構(gòu)建腸道菌群失調(diào)小鼠模型，通過(guò)比較模型組和活菌組糞便中菌群豐度及多樣性變化，評(píng)價(jià)LC01菌株對(duì)青霉素導(dǎo)致的小鼠腸道菌群失調(diào)的改善作用。

圖4 不同LC01菌株劑量對(duì)青霉素引起的小鼠腸道菌群豐度變化的恢復(fù)作用差異Fig. 4 Effect of different doses of LC01 on changes in relative abundance of intestinal microbiota in penicillin-treated mice

如圖4所示，相對(duì)于模型組，青霉素菌群失調(diào)小鼠灌胃兩周LC01菌株（300億或者600億）后，腸道優(yōu)勢(shì)菌屬擬桿菌屬、梭菌屬的相對(duì)豐度顯著恢復(fù)，乳桿菌屬的相對(duì)豐度則顯著增加，且600億組的效果優(yōu)于300億組。該研究結(jié)果表明LC01菌株有助于改善青霉素所致失調(diào)菌群，提示LC01在調(diào)節(jié)菌群失調(diào)方面具有一定潛力。

2.2.2 LC01菌株對(duì)青霉素干預(yù)小鼠腸道菌群不同菌屬相對(duì)豐度的影響

如圖5所示，與模型組相比，服用LC01菌株實(shí)驗(yàn)組的Lactobacillus屬相對(duì)豐度均有所增加，300億組可以基本恢復(fù)到青霉素處理前的水平，而600億組則可以顯著增加乳桿菌相對(duì)豐度，由模型組的（0.62±0.19）%提高至（9.92±3.25）%（P＜0.001）。同時(shí)，活菌組的梭菌目和毛螺菌科未定菌屬的相對(duì)豐度均顯著增加（P＜0.05）。梭菌目和毛螺菌科未定菌屬代謝所產(chǎn)生的丁酸對(duì)腸癌具有顯著的預(yù)防作用[24-26]，提示LC01菌株可通過(guò)調(diào)節(jié)梭菌目和毛螺菌科未定菌的豐度來(lái)預(yù)防腸癌的發(fā)生。另外，600億組極顯著恢復(fù)了瘤胃菌科未定菌屬以及Bacteroides屬的豐度（P＜0.01)，并顯著降低Prevotella屬、Helicobacter屬、Rikenellaceae未定菌屬（Alistipes屬為其代表性屬）和Parabacteroides屬豐度。其中，600 億活菌的Prevotella屬和Helicobacter屬豐度降低最為顯著（P＜0.001）。綜上結(jié)果表明，LC01菌株可顯著恢復(fù)青霉素引起的小鼠腸道中Lactobacillus屬，梭菌目、毛螺菌科和瘤胃菌科未定菌屬相對(duì)豐度異常，同時(shí)降低條件性致病菌Prevotella屬、Helicobacter屬、Rikenellaceae未定菌屬的相對(duì)豐度，對(duì)青霉素引起的小鼠腸道菌群失調(diào)具有顯著的改善作用。

圖5 青霉素建模后LC01菌株恢復(fù)和正?；謴?fù)小鼠腸道菌群屬水平豐度差異分析Fig. 5 Variation analysis of relative abundance of intestinal microbiota between the LC01 treatment group and the control group at the genus level

2.2.3 LC01菌株對(duì)小鼠腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

便秘是一種常見(jiàn)的功能性胃腸道疾病，也是許多高死亡率疾病的誘發(fā)因素，已嚴(yán)重影響了人們的身體健康和生活質(zhì)量[27-28]。研究表明，益生菌能夠有效地緩解小鼠便秘，提示其在緩解便秘方面具有較大的潛力[29-30]。洛哌丁胺是一種阿片受體激動(dòng)劑，可作用于腸壁阻止乙酰膽堿和前列腺素的釋放，導(dǎo)致腸道蠕動(dòng)的減緩，因而常用于便秘模型的造模[30]。本研究利用洛哌丁胺構(gòu)建便秘小鼠模型，通過(guò)比較模型組和活菌組的排便數(shù)量、排便質(zhì)量以及腸道推進(jìn)率，評(píng)價(jià)LC01菌株對(duì)便秘小鼠腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

圖6 LC01菌株對(duì)小鼠腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Fig. 6 Effect of LC01 on intestinal peristalsis in mice

由圖6可知，在洛哌丁胺干預(yù)后，模型組5 h內(nèi)的排便數(shù)量、排便質(zhì)量和腸道推進(jìn)率分別為（1.6±1.0）粒、（25.4±17.3）g和（44.1±7.2）%，與空白組的（16.4±3.4）粒、（132.4±36.4）g和（57.22±4.60）%均有高度顯著差異（P＜0.001），說(shuō)明造模成功。在LC01干預(yù)組中，5 h內(nèi)的排便數(shù)量由模型組的（1.6±1.0）粒增加到300億組的（4.6±1.7）粒和600億組的（80.0±2.9）粒；排便質(zhì)量由模型組的（25.4±17.3）g增加到300億組的（55.0±19.8）g和600億組的（82.0±16.9）g；腸道推進(jìn)速率由模型組的（44.1±7.2）%恢復(fù)到300億組的（50.6±4.2）%和600億組的（55.2±4.1）%。上述結(jié)果表明，LC01菌株可以顯著提高小鼠腸道的推進(jìn)速率，增加排便數(shù)量和質(zhì)量，從而有效緩解便秘。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)探究了干酪乳桿菌LC01菌株對(duì)小鼠腸道菌群和腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LC01菌株可明顯提高正常小鼠腸道中Lactobacillus屬和Bacteroides屬的相對(duì)豐度，降低條件性致病菌Prevotella屬、Helicobacter屬的相對(duì)豐度，對(duì)小鼠腸道菌群具有顯著的調(diào)節(jié)作用。另外，LC01菌株能夠顯著改善青霉素所致腸道菌群失調(diào)，并可促進(jìn)洛哌丁胺引起的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)速率緩慢癥狀的恢復(fù)。綜上，LC01菌株對(duì)小鼠腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用，并且對(duì)腸道轉(zhuǎn)運(yùn)有著良好的促進(jìn)作用，說(shuō)明LC01菌株具有潛在的益生作用，有利于腸道健康。