劉雪兒，馬金鳳，楊成德，李統(tǒng)華

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

不科學(xué)的使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，影響生態(tài)平衡，加劇“3R”問題，并且使病原物產(chǎn)生抗藥性[1]，這與生態(tài)農(nóng)業(yè)的目標(biāo)相悖。生物防治主要利用有益微生物對(duì)病原菌的拮抗作用來減少病原物的數(shù)量和削弱其致病性，同時(shí)誘導(dǎo)或增強(qiáng)植物抗病性[2]。目前國內(nèi)在黃瓜枯萎病(Fusariumoxysporumf. sp.cucumerinum)[3]、西瓜枯萎病(Fusariumoxysporumf. sp.niveum)[4]、甜菜根腐病(Fusariumspp.)[5]和煙草黑脛病(Phytophthoranicotianae)[6]等作物土傳病害生物防治研究較多。根際指植物根系與土壤微生物之間相互作用所形成的獨(dú)特圈帶[7]；根際微生物是在植物根系直接影響的土壤范圍內(nèi)生長繁殖的微生物，與植物關(guān)系密切，種類繁多[8]，且不同植物、不同耕作方式，土壤細(xì)菌的群落組成也不盡相同[9-12]，其中存在許多對(duì)植物有益的細(xì)菌群落，包括生防細(xì)菌、能生產(chǎn)植物生長激素的細(xì)菌和固氮菌等[9]，是微生物資源寶庫之一。針茅屬(Stipa)植物屬于旱生、中旱生、廣旱生密叢型禾草，在中國主要分布于內(nèi)蒙古高原、黃土高原、青藏高原及新疆阿爾泰山和天山等山地[13]，其中異針茅(S.aliena)和疏花針茅(S.penillata)主要分布于較濕潤的高寒地區(qū)，是組成高寒草甸草原的主要優(yōu)勢種，本氏針茅(S.capillata)是一種較喜暖的旱生叢生禾草，是我國暖溫型典型草原的建群種，紫花針茅(S.purpurea)是青藏高原的特有成分，廣泛分布于青藏高原海拔 4500～5200 m 的高原及山地，最高可達(dá)到5400 m[13]，在這種極端生境下其根際土壤細(xì)菌是否豐富？拮抗功能是否強(qiáng)大？因此，本試驗(yàn)以青海高寒草地針茅根際土壤細(xì)菌為研究對(duì)象，以番茄早疫病菌(Alternariasolani)、馬鈴薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)、馬鈴薯壞疽病菌(Phomafoveata)和馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)為指示菌評(píng)價(jià)其拮抗能力并進(jìn)行鑒定，以期為青海高寒草地針茅根際土壤細(xì)菌的開發(fā)提供依據(jù)，也為農(nóng)業(yè)生防菌劑的開發(fā)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試土樣及菌種 供試土樣：于2016年8月在青海省海晏縣青海湖鄉(xiāng)達(dá)五德吉村(東經(jīng)100°52′42″，北緯37°04′08″)采集異針茅、疏花針茅、本氏針茅和紫花針茅根際土壤樣品，隨機(jī)挖取5叢植株及根系周圍土壤帶回實(shí)驗(yàn)室，將植株根系從土壤中輕輕分出，抖落其表面土壤視為根際土立即進(jìn)行分離培養(yǎng)。

供試病原菌：番茄早疫病菌、馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯壞疽病菌和馬鈴薯炭疽病菌均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原細(xì)菌及細(xì)菌多樣性實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2供試培養(yǎng)基[14]牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨6 g、葡萄糖15 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L;LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 L，用于根際土壤細(xì)菌分離培養(yǎng)。

馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，用于病原真菌培養(yǎng)及對(duì)峙培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1土壤細(xì)菌的分離及純化 將10 g土樣，置于盛有90 mL無菌水的三角瓶中，在28 ℃搖床上振蕩約30 min，逐級(jí)稀釋至10-4和10-5mol ·L-1，分別取各濃度對(duì)應(yīng)的土壤懸浮液0.1 mL 均勻涂布于固體LB平板上，每個(gè)濃度梯度重復(fù)3次，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h；統(tǒng)計(jì)所有重復(fù)的菌落數(shù)并挑選其培養(yǎng)特征明顯相異的單個(gè)菌落，于LB平板進(jìn)行劃線純化，后于4 ℃保存?zhèn)溆肹15]。

1.2.2土壤細(xì)菌培養(yǎng)形狀及形態(tài)觀察 將土壤細(xì)菌接種于NA培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，觀察單菌落形態(tài)特征并描述；將活化18 h后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體顏色和形態(tài)，并進(jìn)行大小測量(30個(gè))和顯微拍照[14]。

1.2.3拮抗功能評(píng)價(jià) 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[16]評(píng)價(jià)土壤細(xì)菌對(duì)4種指示菌的拮抗能力。首先，用直徑為6 mm的打孔器在4種指示菌平板邊緣打孔，并將指示菌菌餅接入PDA平板中央，其次，用無菌牙簽在病原菌菌餅周圍2.5 cm等距離接種待測細(xì)菌，每處理重復(fù)3次，馬鈴薯壞疽病菌置于15 ℃培養(yǎng)，其他3種指示菌于28 ℃條件下培養(yǎng)，直至對(duì)照菌落滿皿后用十字交叉法測量抑菌直徑并計(jì)算抑菌率。

抑菌率=(對(duì)照的菌落直徑-處理的菌落直徑)/(對(duì)照的菌落直徑-菌餅直徑)×100%

1.2.416S rDNA鑒定 土壤細(xì)菌活化后在LB培養(yǎng)液中振蕩過夜培養(yǎng)，后按天根生化科技有限公司試劑盒(離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒)提取DNA，利用16S rDNA通用引物：引物27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和引物 1492 R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16]；PCR擴(kuò)增體系為50 μL，其中DNA模板2 μL，Master Mix 25 μL，1492R 2 μL，27F 2 μL，ddH2O 19 μL。

PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min預(yù)變性，之后94 ℃ 30 s變性、60 ℃ 30 s退火、72 ℃ 90 s延伸，共30個(gè)循環(huán)，再72 ℃ 10 min延伸完成擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至武漢金開瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序，所測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)并用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用 Excel 2010統(tǒng)計(jì)分析并處理數(shù)據(jù)，并用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌的分離和純化

將青海采集的異針茅、本氏針茅、紫花針茅和疏花針茅根際土壤樣品經(jīng)稀釋分離培養(yǎng)，在10-5mol·L-1濃度下, 能夠形成清晰獨(dú)立的菌落。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，該生境土壤細(xì)菌數(shù)量較豐富，菌落數(shù)介于106～107cfu·g-1(表1)。

表1 針茅屬根際土壤細(xì)菌數(shù)Table 1 Soil bacteria amounts of the Stipa rhizosphere (cfu·g-1)

根據(jù)培養(yǎng)性狀，異針茅根際土壤樣品中分離到8株土壤細(xì)菌，分別編號(hào)為3T1至3T8；本氏針茅根際土壤樣品中分離到6株土壤細(xì)菌，分別編號(hào)為4T1、4T2、4T3、4T4、4T5和4T7；紫花針茅根際土壤樣品中分離到6株土壤細(xì)菌，分別編號(hào)為5T1、5T2、5T3、5T6、5T7和5T8；疏花針茅根際土壤樣品中分離得到3株土壤細(xì)菌，分別編號(hào)為10T1至10T3。共分離得到23株菌株，保存?zhèn)溆?，但在研究過程中6株菌株失活，不能再繼代培養(yǎng)。

2.2 培養(yǎng)形狀及形態(tài)觀察

2.2.1培養(yǎng)形狀觀察 根據(jù)表2，異針茅根際土壤細(xì)菌菌落均為圓形，菌落大小為2～6 mm，除3T5表面無光澤外，其他表面都有光澤且凸起，基本不透明，菌落顏色為乳白色或乳黃色；本氏針茅根際土壤細(xì)菌除4T3菌落為不規(guī)則形外其他均為圓形，菌落大小為0.1～8.5 mm，4T3和4T5表面無光澤，其他表面都有光澤且凸起，基本不透明，菌落顏色為白色或黃色；紫花針茅根際土壤細(xì)菌菌落均為圓形，菌落大小為2～5 mm，5T2表面無光澤，其他表面都有光澤且凸起，基本不透明，菌落顏色為白色或者黃色；疏花針茅根際土壤細(xì)菌中，10T1菌落為不規(guī)則形其余都為圓形，菌落大小為2～6 mm，10T1表面無光澤且平展，其他表面都有光澤且凸起，基本不透明，菌落顏色為白色或者黃色。該結(jié)果表明青海高寒草地不同種針茅根際土壤細(xì)菌培養(yǎng)性狀差異明顯。

2.2.2形態(tài)觀察 23株土壤細(xì)菌均呈革蘭氏陽性，桿狀(表3)。異針茅根際土壤細(xì)菌菌體差別明顯，其中3T7菌體最長，達(dá)9.98 μm，3T6菌體最寬， 為2.93 μm，其他菌株介于兩者間； 本氏針茅根際土壤細(xì)菌中菌體最長和最寬的菌株分別為4T5和4T3，分別達(dá)9.91和3.03 μm，其他菌株介于兩者間；在紫花針茅根際土壤細(xì)菌中，菌體最長和最寬的菌株均為5T2，分別為10.5和2.37 μm，其他菌株介于兩者間；疏花針茅根際土壤細(xì)菌10T1菌體最長，為6.04 μm，10T3菌體最寬，為1.72 μm，其他菌株介于兩者間?？傮w看，針茅屬不同種根際土壤細(xì)菌表現(xiàn)出明顯的形態(tài)差異。

G+: 革蘭氏陽性 Gram-positive bacteria.

2.3 拮抗功能評(píng)價(jià)

結(jié)果表明，青海高寒草地異針茅、本氏針茅、紫花針茅和疏花針茅根際土壤細(xì)菌中拮抗菌所占比例為0、17%、17%和67%，其中具有強(qiáng)拮抗能力的菌株為4T1、5T1、10T1和10T3，特別是10T1對(duì)番茄早疫病菌、馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯壞疽病菌和馬鈴薯炭疽病菌的抑菌率分別為67.14%、68.57%、61.43%和75.71%(圖1，表4)?？傮w看高寒草地針茅根際土壤細(xì)菌中具有較多拮抗菌株，且抑菌能力強(qiáng)，抑菌譜較廣，但不同種間根際土壤細(xì)菌拮抗能力有差異。

表4 優(yōu)良拮抗土壤細(xì)菌的抑菌作用Table 4 Antagonistic effect of excellent antagonistic soil bacteria (%)

圖1 10T1的抑菌作用Fig.1 The antagonistic effect of 10T1 A: 番茄早疫病菌A. solani; B: 馬鈴薯壞疽病菌P. foveata; C: 馬鈴薯炭疽病菌C. coccodes; D: 馬鈴薯枯萎病菌F. avenaceum.

2.4 16S rDNA序列分析

對(duì)17株可以繼代培養(yǎng)的菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序，于GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，將此17株菌鑒定為7屬12種(表5)，其中8株土壤細(xì)菌鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，其中3T2和4T5為簡單芽孢桿菌(B.simplex)、4T2和4T3為蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、10T1為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、5T2為蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、3T5為維德曼芽孢桿菌(B.wiedmannii)，3T8為韋氏芽孢桿菌(B.weihenstephanensis)，占總株數(shù)的47.05%，為優(yōu)勢屬。另外，將3T4、3T7和4T7鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，3T6鑒定為摩拉維亞假單胞菌(Pseudomonasmoraviensis)，5T3和10T2鑒定為乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoacetius)，4T1鑒定為成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)，5T7鑒定為藤黃微球菌(Micrococcusluteus)，5T8鑒定為氧化微桿菌(Microbacteriumoxydans)(圖2)。

表5 針茅屬不同根際土壤細(xì)菌的種類Table 5 Soil bacteria types of the Stipa rhizosphere

圖2 針茅屬根際土壤細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Soil bacteria phylogenetic tree of the Stipa rhizosphere

異針茅根際土樣中共分離到6株菌，其中3株為芽孢桿菌屬，2株為寡養(yǎng)食單胞菌屬，1株為假單胞菌屬，且假單胞菌屬為異針茅所特有(表5)；本氏針茅根際土樣中分離到5株菌，其中3株為芽孢桿菌屬，1株為寡養(yǎng)食單胞菌屬，1株為泛菌屬，且泛菌屬為本氏針茅所特有；紫花針茅根際土樣中4株菌，分別屬于芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、微球菌屬和微桿菌屬；疏花針茅根際土樣中的2株菌分別屬于芽孢桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬。

3 討論與結(jié)論

土壤細(xì)菌是土壤中最豐富，分布最廣泛的微生物類群[17-18]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中又可分為有益和有害細(xì)菌。為了農(nóng)業(yè)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，人們對(duì)有益細(xì)菌進(jìn)行了大量研究。早在1962年，張憲武等[19]已開始大豆(Glycinemax)根際土壤細(xì)菌的研究，但是有關(guān)高寒極端生境土壤細(xì)菌的研究報(bào)道較少。種植地區(qū)、耕作方式及作物種類等因素不同，土壤細(xì)菌的數(shù)量也存在差異。李榮坦等[20]研究低磷脅迫對(duì)番茄(Solanumlycopersicum)根際土壤細(xì)菌多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)低磷脅迫處理下，“紅寶石1號(hào)”根際可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量最多，為40.32×106cfu·g-1；江曙等[21]對(duì)不同地區(qū)當(dāng)歸(Angelicasinensis)根際微生物種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在當(dāng)歸生長過程中，微生物數(shù)量逐漸增加，10月以后又開始下降，且岷當(dāng)歸根際中分離到36株細(xì)菌，細(xì)菌數(shù)量最多時(shí)達(dá)(124.6±6.8)×106cfu·g-1。本試驗(yàn)所研究的針茅根際土壤中分離的細(xì)菌數(shù)量介于6.4×106～36.0×106cfu·g-1，與以上文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

高明華等[22]對(duì)呼倫貝爾草甸草原優(yōu)勢種群羊草(Leymuschinensis)根際微生物進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，羊草根際土壤中共分離得到36株細(xì)菌，分屬于7個(gè)屬，其中芽孢桿菌屬17株；周陽薇等[23]對(duì)12種不同植物根際的土壤細(xì)菌進(jìn)行了分離，并初步確定了細(xì)菌的分類地位，共得到137株細(xì)菌，分屬于8個(gè)屬，且芽孢桿菌屬為優(yōu)勢屬，占81.0%。而本試驗(yàn)從4份針茅根際土樣中分離得到23株細(xì)菌，17株可轉(zhuǎn)代，分屬于7個(gè)屬，其中芽孢桿菌屬8株，為優(yōu)勢屬，從菌株數(shù)看較少，但屬數(shù)與上述文獻(xiàn)基本一致。

生防細(xì)菌具有繁殖速度快、代謝產(chǎn)物復(fù)雜多樣、與病原菌作用方式廣、易于培養(yǎng)等特點(diǎn)，且生防芽孢桿菌抗逆性強(qiáng)，具有良好的生防效果[24]。據(jù)報(bào)道蘇云金芽孢桿菌[25]、蠟狀芽孢桿菌[26]和解淀粉芽孢桿菌[27]均具有良好的生物防治作用，其中蘇云金芽孢桿菌常用來防治各種農(nóng)業(yè)害蟲和植物寄生線蟲，蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌常用來防治各種植物病害。本試驗(yàn)共分離得到23株細(xì)菌，其中4株具有強(qiáng)抑菌作用，特別是疏花針茅根際菌株10T1對(duì)番茄早疫病菌、馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯壞疽病菌和馬鈴薯炭疽病菌的抑菌率分別為67.14%、68.57%、 61.43%和75.71%，并將其初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌。馮中紅等[28]從東祁連山高寒草地牧草分離篩選的內(nèi)生細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌264ZY7對(duì)馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯枯萎病菌的抑菌率分別為38.17%和49.60%；馮金龍等[29]報(bào)道解淀粉芽孢桿菌S27對(duì)馬鈴薯枯萎病菌和馬鈴薯炭疽病菌都有良好的抑菌效果，其中對(duì)馬鈴薯炭疽病菌的抑菌率為75%；暢濤等[30]報(bào)道解淀粉芽孢桿菌B-401對(duì)馬鈴薯壞疽病菌、馬鈴薯炭疽病菌和番茄早疫病菌的抑菌率分別為74.45%、70.05%和60.25%。此外，還有報(bào)道解淀粉芽孢桿菌可以防治番茄枯萎病[24]、玉米(Zeamays)紋枯病[31]、絲瓜(Luffacylindrica)炭疽病[32]和草莓(Fragariaananassa)灰霉病[33]等植物病害。本試驗(yàn)所分離的解淀粉芽孢桿菌10T1具有廣譜抑菌作用，對(duì)馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯枯萎病菌的抑菌率高于馮中紅等[28]的報(bào)道，與馮金龍等[29]和暢濤等[30]的報(bào)道基本一致，對(duì)番茄早疫病菌的抑菌率高于暢濤等[30]的報(bào)道，說明菌株10T1抑菌譜寬，抑菌能力強(qiáng)，有被開發(fā)為良好的生防制劑的潛力。

隨著人們對(duì)極端環(huán)境微生物的深入了解，意識(shí)到極端生境微生物為適應(yīng)極端環(huán)境形成了獨(dú)特的生物活性物質(zhì)合成途徑或者代謝途徑，并能產(chǎn)生許多特殊的生物活性物質(zhì)，有良好的開發(fā)前景，如嗜冷菌產(chǎn)生的低溫酶，在洗滌防治、食品加工、植物保護(hù)、環(huán)境保護(hù)等方面起著至關(guān)重要的作用[34]。本試驗(yàn)所分離菌株均能在青海海拔高，氣候寒冷，溫度低的極端生境生存，抗逆能力強(qiáng)，可能具有良好的開發(fā)應(yīng)用潛力。但本試驗(yàn)僅對(duì)室內(nèi)抑菌功能進(jìn)行了測定，還需進(jìn)一步研究其抑菌譜、抑菌機(jī)理及發(fā)酵條件等，為生防菌劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。